[发明专利]一种蓝藻气囊提取方法及其应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种蓝藻气囊提取方法及其应用。本申请建立了一个快速、高效提取微囊藻气囊的方法(“H₂O₂法”)。具体步骤包括：S1：调整藻细胞浓度为(0.5‑8.0)×10⁷个/mL；S2：加入0.02‑3.5mol/L的过氧化氢；S3：摇晃处理5‑240min；S4：将处理后的藻液低温离心；S5：取离心后的上层白色乳状物与PBS溶液等比例混合，低温离心，保留白色漂浮层即为气囊。该技术为进一步开发生物合成的超声造影剂提供了技术支撑，展现出较好的工业潜力，同时也对研究气囊的精细结构提供了原材料。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种蓝藻气囊提取方法及其应用。

背景技术

超声成像作为临床诊断和生物学研究的常用手段，具有高时空分辨率、深穿透性和低成 本等优点，特别是超声造影剂的靶向修饰可在分子水平上无创显示血栓、炎症及肿瘤血管， 进行靶向检测和治疗，拓宽了传统成像模式的诊断能力和实用性。除了超声诊断外，携带药 物的微泡造影剂在受到低强度的超声辐射时，发生爆破并释放药物，其发生的空化效应使附 近的毛细血管和细胞通透性增高，提高了相应组织对药物的摄取率。因而，超声造影剂在脑 部、心血管和癌症等重大疾病的检测和治疗中具有重要的应用前景。

目前，临床上使用较多的造影剂是人工合成的由脂质、聚合物或蛋白外壳包裹气体的直 径为几微米(1-8μm)的微泡。因其体积较大，只能在血管内成像，无法穿过血管壁进入非 血管肿瘤部位。因此这类微泡在生物医学上的应用受到了限制，同时还存在生物安全性的问 题。

最近的研究发现，来源于蓝藻和古菌内的气囊能显著增强超声成像的效果，使其具有作 为纳米级超声造影剂的潜质。气囊是由蛋白质外壳包裹气体形成的中空纺锤体状或圆柱体状 结构，长度为200nm-2000nm，直径为45nm–200nm。因气囊内部气体和周围介质之间的 声阻抗不同使得气囊能够散射声波，产生谐波信号，可以显著增强含气囊区域的对比度，并 提供可区分的超声信号。由于其纳米级尺寸和谐波产生能力，使气囊在肿瘤成像中展现出巨 大的潜力。

气囊主要存在于蓝藻和古菌中，目前研究发现参与气囊形成的基因有gvpA₁A₂A₃CNKJKFGWV，其中Gvp A和Gvp C是形成气囊的主要结构组成蛋白。Gvp A具有 很强的疏水性，在气囊壁上形成间距为4.6nm的棱纹结构。Gvp C位于气囊的外表面，与Gvp A相互作用增强气囊壁的强度。其他相关蛋白功能未知。为了将气囊广泛应用于临床研究中，2018年Shapiro团队通过基因工程的方法将表达气囊的基因簇(ARG1)密码子优化后在大肠杆菌中表达，发现这些表达气囊的大肠杆菌也具有超声造影属性。随后,他们在肠道益生菌ECN(E.coli strain Nissle 1917)中表达了ARGs,来验证表达ARGs的细胞在体内的可检测性， 实现了活体微生物超声成像。另外，Farhadi等采用多质粒共转染系统，将mARGs(哺乳动 物声学报告基因，包括来自于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的gvpBNFGLSKJU)稳定表 达于HEK-293T人体肾脏细胞，成功表达了气囊。随后将上述HEK细胞注射于免疫缺陷小鼠 腿部构建肿瘤模型。结果显示在超声成像下，报告基因的信号可清晰地勾勒出肿瘤组织的轮 廓。这说明作为一种新型的超声造影剂，气囊为超声分子成像和疾病检测提供了新的技术手 段。

除上述在异源细胞中表达气囊的操纵子获得气囊以外，另一种策略是直接从蓝藻或古菌 中提取气囊，直接或修饰后进行超声成像。因藻类易于培养，且气囊含量丰富，是理想的气 囊制备原料。现有的从蓝藻中提取气囊的方法包括：

2017年，《微生物学通报》公开了一种水华蓝藻气囊的分离纯化方法：这里称为“高渗 裂解法”，具体步骤为：