[发明专利]一种鸭坦布苏病毒致弱活疫苗候选株及其制备方法和应用

说明书

本发明中公开了一种鸭坦布苏病毒致弱活疫苗候选株，该候选株为鸭坦布苏ΔC64‑96突变病毒株，所述鸭坦布苏ΔC64‑96突变病毒株为基因缺失突变病毒株，其缺失的基因序列为编码鸭坦布苏病毒Capsid蛋白第64位‑第96位氨基酸的核苷酸序列。该致弱活疫苗候选株在病毒粒子的装配过程中存在缺陷，导致病毒致弱，其致弱机制被清楚解析，有效提高疫苗的使用安全性；且该致弱活疫苗候选株对雏鸭的单次免疫就能显著激活受感染雏鸭的免疫系统，且能提供强有效的免疫保护效果。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒致弱活疫苗候选株及其制备方法和应用。

背景技术

鸭坦布苏病毒病自2010年在中国东南沿海地区首次爆发以来，迅速扩散大到全国多个省市，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。鸭坦布苏病是一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。当前对该病的防控措施尚不完善，虽然已有商品化的减毒活疫苗和灭活疫苗，但目前该病仍呈现地区性流。已有的商品化灭活疫苗安全性较高，但是灭活疫苗的生产成本高，对运输、保存条件要求严格，且免疫效果不够理想，需要多次增强免疫，加大了鸭群的应激反应。而现有的减毒活疫苗都是通过传统连续传代，使病毒在适应异源宿主细胞过程中产生适应性突变，最终获得减毒的具有免疫原性的表型。这种方式获得的减毒的疫苗候选株的病毒致弱分子机制不清楚，或是未完全解析清楚；由于缺少对其详细的机制的了解，将限制对其自然回复到强毒表型的风险的评估，因此安全风险较高。所以，当前的DTMUV的疫苗仍有很大的提高空间，尤其需要研制一种安全性高、免疫效果好的DTMUV疫苗。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的鸭坦布苏病毒减毒疫苗安全性低，免疫效果不理想的问题，提供一种鸭坦布苏病毒致弱活疫苗候选株，该候选株为鸭坦布苏ΔC64-96突变病毒株，鸭坦布苏ΔC64-96突变病毒株在病毒粒子的装配过程中存在缺陷，导致病毒致弱，其致弱机制被清楚解析，有效提高该致弱活疫苗候选株的使用安全性；且鸭坦布苏ΔC64-96突变病毒株对雏鸭的单次免疫就能显著激活受免疫雏鸭的免疫系统，极大提高免疫效果。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种鸭坦布苏病毒致弱活疫苗候选株，该候选株为鸭坦布苏ΔC64-96突变病毒株，所述鸭坦布苏ΔC64-96突变病毒株为基因缺失突变病毒株，其缺失的基因序列为编码鸭坦布苏病毒Capsid蛋白第64位-第96位氨基酸的核苷酸序列。

本发明还提供上述鸭坦布苏致弱活疫苗候选株的制备方法，，包括以下步骤：

S1、以鸭坦布苏病毒株DTMUV-CQW1株的pACNR-FL-CQW1质粒为模板，以序列SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2为引物，PCR扩增得到片段P1；以序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，PCR扩增得到片段P2；再以片段P1和片段P2为模板，以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4为引物，通过融合PCR扩增得到基因缺失突变的片段P1P2，所述片段P1P2缺失的基因序列为编码鸭坦布苏病毒的Capsid蛋白第64位-第96位氨基酸的核苷酸序列；

S2、将pACNR-FL-CQW1质粒用限制性内切酶MluI和XhoI进行双酶切，并回收纯化，获得纯化的线性pACNR-FL-CQW1质粒载体；

S3、将步骤S1中的基因片段P1P2与步骤S2中的纯化的线性pACNR-FL-CQW1质粒载体进行重组连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性菌落测序鉴定，获得重组质粒，并命名为pACNR-FL-CQW1-ΔC64-96质粒；

S4、将步骤S3中的pACNR-FL-CQW1-ΔC64-96质粒转染BHK21细胞，培养5天后收获上清液，即获得鸭坦布苏ΔC64-96突变病毒株。