[发明专利]糖原磷酸化酶基因的cRNA原位杂交探针及其制备方法

说明书

本发明公开了一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针及其制备方法，该探针的序列如序列1所示。本发明对活体动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中糖原磷酸化酶(脑型)基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中糖原磷酸化酶(脑型)基因mRNA水平的变化。本发明使用的糖原磷酸化酶(脑型)的探针序列，对糖原磷酸化酶(脑型)基因mRNA的显示有明确的特异性，实现了对糖原磷酸化酶(脑型)基因mRNA水平的显示作用。

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其涉及一种糖原磷酸化酶基因的cRNA原位杂交探针及其制备方法。

背景技术

越来越多的实验证据支持糖、脂、氨基酸和神经营养因子代谢异常在抑郁症的发生发展中发挥着重要作用。以往糖原代谢研究主要关注于肝脏和肌肉组织，脑糖原的研究较少，与脑糖原相关的疾病研究更加有限。在糖原分解代谢过程中起着重要作用的酶是糖原磷酸化酶。糖原磷酸化酶是糖原分解途径中最重要的关键酶，是一种大分子蛋白聚合体，具备多个功能结构域，包括催化域、糖原结合域和变构域等，主要在脑组织和胎盘中表达。糖原磷酸化酶在应激状态下，能够快速催化分解糖原，为脑组织提供短暂的能量供应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

本发明的一个方面，公开了一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针，该探针的序列如序列1所示。

本发明的第二个方面，公开了一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针的制备方法，具体步骤包括：

(1)根据糖原磷酸化酶(脑型)的Gene bank序列设计了糖原磷酸化酶(脑型)特异的引物，并且此对引物扩增出937bp的糖原磷酸化酶(脑型)片段作为糖原磷酸化酶(脑型)特异的探针序列；

(2)构建糖原磷酸化酶(脑型)的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；

(3)制备糖原磷酸化酶(脑型)的cRNA原位杂交探针；

(4)检测糖原磷酸化酶(脑型)的cRNA探针的原位杂交。

进一步地，步骤(1)中糖原磷酸化酶(脑型)特异的引物是：

上游引物：5′ATGGTCCCCACAGCTTCA 3′；

下游引物：5′GGCTTCAGGGGACCTCAT 3′。

进一步地，步骤(2)按照如下步骤进行：

(a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增；

(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；

(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接；

(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。

进一步地，步骤(3)按照如下步骤进行：

(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后，经判断确认糖原磷酸化酶(脑型)探针序列插入载体的顺序是正向的；

(b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切；

(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；

(d)用SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。

进一步地，步骤(4)按照如下步骤进行：