[发明专利]一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用

说明书

本发明公开了一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用，属于生物分子改造及基因工程技术领域。本发明通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达载体pP43NMKmut‑C4‑yncM‑Dac的信号肽进行筛选和优化，提高几丁二糖脱乙酰酶Dac的分泌效率，提高酶活，并构建了可以稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的食品安全级工程菌株。与现有技术相比，几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活得到了极大的提高。本转化方法简单易行，条件温和，高效环保，产物得率高。此法有利于解决传统合成法中污染严重，产率低下等问题，而且此法易于控制，利于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用，属于生物分子改造及基因工程技术领域。

背景技术

几丁二糖脱乙酰酶Dac属于糖类酯酶，对乙酰氨基葡萄糖单体依然具有很高的催化活性，在代谢途径中首先作用的底物为几丁寡糖GlcNAcn或几丁二糖GlcNAc2，从GlcNAcn或GlcNAc2的还原端水解下乙酰基团，生成非还原性末端部分乙酰化的GlcNAc-GlcN后，在外切氨基葡萄糖苷酶GlmA的水解作用下，将GlcNAc-GlcN水解成N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc和氨基葡萄糖GlcN，此后，几丁二糖脱乙酰酶Dac再作用于生成的N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc单体，将其水解成氨基葡萄糖GlcN。

相较于目前市场上存在的多针对以寡聚体或多聚体形式存在的乙酰氨基葡萄糖有催化活性的脱乙酰酶，来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的几丁二糖脱乙酰酶Dac可以利用N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为底物进行单酶催化反应，实现氨基葡萄糖GlcN的一步高效生产。

氨基葡萄糖GlcN是一种重要的功能性单糖，在生物体的生长过程中起着不可替代的作用。作为组成黏膜分泌物、结缔组织、皮肤、肌腱、韧带和软骨等必不可少的成分，氨基葡萄糖GlcN在许多国家已被列为医药品行列。氨基葡萄糖GlcN除了在治疗软骨性关节炎方面有着良好的作用外，对肝癌细胞的生长也有一定的抑制作用。

目前，氨基葡萄糖GlcN在许多国家已被列入医药品行列，其生产方式一般为甲壳素水解法和微生物发酵法。其中，甲壳素水解法常用强酸热解以脱除乙酰基，容易产生大量的环境污染物，而且原料会受到地域和季节的限制，获得的产品中乙酰基的脱除程度不一致，导致产品均一性差。微生物发酵法虽然克服了化学水解法带来的严重污染，但发酵液中难以实现氨基葡萄糖GlcN的高浓度积累。由于氨基葡萄糖GlcN存在广泛的市场，因此，探寻一种更高效、更安全的氨基葡萄糖GlcN生产方法势在必行。

枯草芽胞杆菌作为一种典型的模式工业微生物，具有遗传背景清晰、基因编辑成熟等优点。随着对枯草芽孢杆菌遗传调控机制的不断揭示，作为异源蛋白表达“细胞工厂”的枯草芽胞杆菌已被证实基因组上包含很多对生长和异源酶表达不利的非必需基因，如：前噬菌体、菌体自溶、芽胞形成、异源酶转录负调控因子等基因，现如今通过对其基因组进行删减的手段，合理设计简化细胞内的调控代谢网络，为细胞减负的同时提高宿主对异源酶的生产效率，使其成为理想的底盘细胞。

例如记载于公开号为CN109777761B的中国发明专利中，公开了一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的工程菌及其构建方法，通过融合表达几丁二糖脱乙酰酶Dac与yncM信号肽，并获得了5’端的非翻译区突变体，发酵60h胞外酶活最高为1548.7U/ml。

但是，目前的几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活较低，并且现有的几丁二糖脱乙酰酶Dac工程菌仍难以满足工业化利用酶法制备氨基葡萄糖GlcN的最低酶活需求，氨基葡萄糖GlcN在转化过程中的产量和转化率还较低，所以需要进一步提高氨基葡萄糖GlcN的产量。

发明内容