[发明专利]一种基于散射介质实现超分辨显微成像方法及其装置

说明书

本发明属于光学显微成像、散射光学以及计算成像交叉领域。基于散射介质实现超分辨显微成像装置主要由照明装置1、载物台2、待观测目标3、散射介质4、光阑5、面阵探测器6和中央处理器7构成。其中，面阵探测器6与散射介质4之间的距离，需要通过考虑探测的散斑图满足奈奎斯特定理来确定；待观测目标3到散射介质4的距离，由显微成像具体的视场和分辨率来确定。光阑5紧靠散射介质4；待观测目标3置于载物台2上，由中央处理器7控制照明装置1主动引入稀疏且随机点光源照明。本发明还涉及基于散射介质实现超分辨显微成像方法。

技术领域

本发明属于光学显微成像、散射光学以及计算成像交叉领域，具体涉及一种基于散射介质结合计算成像技术。

背景技术

超分辨光学成像技术通常指的是基于远场光学显微镜的超分辨成像技术，主要包括两种实现途径：一种是基于特殊强度分布照明光场的超分辨成像方法(如STED)。另一种是基于单分子成像和定位的方法(如PALM)。1.受激发射损耗显微镜技术(StimulatedEmission Depletion Microscopy，简称STED)该成像理论来源于爱因斯坦的受激辐射理论，德国科学家斯蒂芬·赫尔(Stefan W.Hell)创造性地利用受激辐射来抑制自发荧光辐射，最终实现了受激发射损耗显微镜技术(STED)。一个典型的STED显微镜需要两束严格共轴的激光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光(也称STED光)。利用激发光使艾里斑范围内的荧光分子被激发，其电子从基态跃迁到激发态。随后，使用甜甜圈型(Doughnut，跟救生圈形状类似)的损耗光照射样品，使得处于激发光斑外围的激发态分子以受激辐射的方式释放能量回到基态，而位于激发光斑内部区域的激发态分子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。这种照明方式的组合，将荧光发射区域限制在小于艾里斑的区域内，获得了一个小于衍射极限的荧光发光点。最后，通过在二维(或三维)空间内扫描共轴的激发光和损耗光，获得一幅二维(或三维)超分辨图像。1994年，斯蒂芬·赫尔等人提出了STED显微镜的理论。2000年，斯蒂芬·赫尔研究组通过生物实验证实了STED显微镜的超分辨成像能力。2.光激活定位显微镜技术(Photoactivation Localization Microscopy，简称PALM)阿贝极限指出，在远场无法分辨相距l/2NA的两个荧光分子所成的像，但是并没有对单个荧光分子的中心位置确定精度进行限制。如果在艾里斑内仅有一个分子在发射荧光，我们可以利用单分子定位算法并结合光学系统艾里斑的形状，以超高精度(纳米量级)获得荧光分子的中心位置。倘若将这个单分子定位思想用于实现超分辨成像，其关键在于如何在一个艾里斑内区分多个荧光分子。为了克服一个艾里斑内只允许一个分子发射荧光的限制，1995年美国科学家埃里克·白兹格(Eric Betzig)通过理论分析，提出可以利用光谱特性对艾里斑内的发射波长不同的荧光分子进行分时探测和中心位置定位，从而实现荧光密集标记样本的超分辨成像。2006年，埃里克·白兹格等人利用光激活绿色荧光蛋白(PA-GFP)的可控荧光开关特性，结合单分子定位算法，实现了生物样本的超分辨成像。他们首先利用低能量的405nm激光(激活光)来稀疏活化PA-GFP，再使用561nm激光(激发光)对活化后的PA-GFP进行单分子荧光成像，直至活化后的PA-GFP分子被光漂白。重复激活-激发-定位-漂白过程，可以在艾里斑内高精度找到大量PA-GFP分子的中心位置，从而重建出一幅由PA-GFP分子中心位置组成的超分辨图像。这种技术被称为光激活定位显微镜(Photoactivation Localization Microscopy,简称PALM)。2006年，哈佛大学的庄小威小组提出了随机光学重建显微镜(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，简称STORM)，其成像原理与PALM类似，但是在密集标记样本内实现荧光发射稀疏化的方案有所不同。

这些传统的显微成像技术无一例外都需要构成的镜头。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何基于散射介质实现超分辨显微成像，不需要使用透镜。

本发明所采用的技术方案是：基于散射介质实现超分辨显微成像方法，按如下步骤进行：