[发明专利]利用双荧光素酶报告基因系统及分子对接技术筛选PGC-1α小分子调控剂的方法

权利要求书

1.一种用于筛选PGC-1α小分子调控剂的人PGC-1α基因启动子片段，其特征在于：所述启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，该片段中的54-55位碱基和71-73位碱基能以氢键作用方式结合PGC-1α小分子调控剂，且54-55位碱基突变不能降低启动子活性，而71-73位碱基突变能使启动子活性降低，

所述PGC-1α小分子调控剂的结构式如下：

。

2.权利要求1所述启动子片段的获得方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）根据人PGC-1α基因序列构建不同启动子的双荧光素酶报告基因载体，加入小分子化合物并检测双荧光素酶活性，筛选出能够直接激活PGC-1α启动子的小分子调控剂；

（2）将能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子序列进行不同长度截短，并构建双荧光素酶报告基因载体，加入小分子调控剂并检测双荧光素酶活性，筛选出能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子截短体，从而确定小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域；

（3）Avogadro软件模拟PGC-1α基因启动子截短片段；

（4）用SYBYL软件对小分子调控剂及PGC-1α基因启动子截短片段进行分子对接，筛选小分子调控剂与PGC-1α基因启动子的结合位点；

（5）根据分子对接结果，针对不同的结合位点构建突变体并进行双荧光素酶活性检测，从而确定小分子调控剂与PGC-1α启动子结合的具体位点。

3.如权利要求2所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（1）中，所述人PGC-1α基因具有8个不同的转录本，对这8个转录本分析后，有4个不同的启动子，根据这4个不同的启动子序列设计引物并构建双荧光素酶报告基因载体。

4.如权利要求3所述启动子片段的获得方法，其特征在于：所述4个启动子的引物序列如SEQ ID No.1-8所示，其中能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子的引物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

5.如权利要求2所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（2）中，首先将能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子序列进行4个不同长度的截短，通过检测双荧光素酶活性确定启动子区域，然后再将启动子区域进一步截短，最终确定小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域。

6.如权利要求5所述启动子片段的获得方法，其特征在于：所述小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域的序列如SEQ ID No.23所示。

7.如权利要求2所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（4）中，所述小分子调控剂与PGC-1α启动子的结合位点位于PGC-1α启动子DNA双螺旋的大沟中，所述小分子调控剂与序列如SEQ ID No.23所示PGC-1α启动子的54-55位碱基和71-73位碱基以氢键作用方式结合。

8.如权利要求7所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（5）中，构建序列如SEQID No.23所示PGC-1α启动子的54-55位碱基和71-73位碱基突变体并验证其活性，其中54-55位碱基突变不能降低启动子活性，而71-73位碱基突变能使启动子活性降低。