[发明专利]一种基于可控相分离液滴对细胞内源基因转录过程的高效控制方法

权利要求书

1.一种对细胞内源基因转录过程的控制方法，基于可控相分离液滴和CRISPR/dCas9技术，在细胞内表达模块化组合的转录因子dCas9-VPR-IDR，同时表达识别靶基因目标序列的sgRNA，在sgRNA的介导下使转录激活因子VPR和蛋白无结构区域IDR锚定到靶基因的启动子区域，并借助IDR间多价相互作用发生相分离形成凝聚体液滴，招募更多的转录机器至靶基因启动子区域，高效促进靶基因的转录。

2.如权利要求1所述的控制方法，其特征在于，通过下述步骤实现对细胞内源基因的高效转录激活：

1)利用分子克隆的办法，将具有相分离能力的蛋白无结构区域IDR与dCas9-VPR融合蛋白相融合，构建dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体；

2)设计与靶基因相匹配的sgRNA，并构建该sgRNA的表达载体；

3)将步骤1)和2)构建的表达载体一同转染进细胞；

4)筛选出转染成功的细胞；

5)利用sgRNA的指引，dCas9作为DNA锚定平台，将转录激活因子VPR与蛋白无结构区域IDR锚定到靶基因的启动子区域；

6)利用IDR间多价相互作用，提高靶基因启动子区域dCas9-VPR-IDR的浓度，并在达到一定浓度后自发在细胞内形成凝聚体液滴；

7)利用液滴的形成招募更多的转录机器至靶基因启动子区域中，高效促进靶基因的转录过程。

3.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，所述IDR的氨基酸序列选自序列表中SEQIDNo：1～10中的一种。

4.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，在步骤1)中，先使dCas9融合上转录激活因子VPR，再融合上蛋白无结构区域IDR，构建dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体。

5.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，在步骤1)构建的dCas9-VPR-IDR融合蛋白的表达载体中，dCas9-VPR-IDR融合蛋白基因采用组成型启动子或诱导型启动子。

6.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，在步骤2)构建的sgRNA的表达载体采用组成型启动子。

7.如权利要求2所述的控制方法，其特征在于，步骤3)采用脂质体转染的方法。

8.如权利要求7所述的控制方法，其特征在于，步骤3)所用脂质体为Lipo-2000。