[发明专利]一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用

说明书

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用，属于林业昆虫分子生物学技术领域。一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因包括RPS26基因和/或RPS15基因。本发明选择了美国白蛾的8个基因作为候选内参基因，通过4种算法评估候选内参基因的稳定性，结果表明RPS26基因和/或RPS15基因适合作为美国白蛾不同种群密度的内参基因在实时荧光定量检测中应用，本发明还设计内参基因的实时荧光定量PCR引物，具有特异性强，扩增效率高的特点。本申请提供的内参基因及其引物填补了美国白蛾不同种群密度下没有合适内参基因的空白，为美国白蛾不同种群实验条件下的相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据。

技术领域

本发明属于林业昆虫分子生物学技术领域，具体涉及一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)又称美国灯蛾、秋幕毛虫和网幕毛虫等，属鳞翅目，大鳞翅亚目，灯蛾科，白蛾属，原产于北美，分布于北纬19°～55°，后传入欧洲和亚洲，严重危害林木和农作物，是一种极易暴发成灾的国际检疫害虫。美国白蛾1940年首次在欧洲的匈牙利发现，并在1945年暴发成灾，随后蔓延至多个国家，在亚洲，1945年在日本东京首次发现美国白蛾，随后传入韩国、朝鲜，1979年首次在我国辽宁丹东被发现，美国白蛾在我国由东向西扩散，截止到2020年，美国白蛾已经涉及北京、天津、河北、内蒙古、辽宁、吉林、上海、江苏、安徽、山东、湖北、陕西、河南13个省(区、市)的597个县级行政区(国家林草局2020年第3号公告)。

实时荧光定量(Reverse transcription quantitative polymerase chain reα-tubion，RT-qPCR)是功能基因表达量的一种精确的定量方法，但它依赖于合适的内参基因对功能基因的相对表达定量进行数据标准化。内参基因必须在特定的实验条件下满足稳定表达的要求。美国白蛾也是一种具有群居习性的害虫，其卵粒常集结成块，幼虫常群集为害或扩散；1～3龄群居在叶背面取食叶肉组织，使被害叶片呈透明状的“白叶”。幼虫4龄前群居于网幕内生活，随虫龄增加网幕扩展，一般50～60cm，长者可达100多cm。因此，美国白蛾在不同生长阶段以不同的种群密度下生长。

目前，还没有美国白蛾不同种群密度下表达量稳定的内参基因的研究报道，这给利用实时荧光定量方法研究美国白蛾不同种群密度下功能基因的差异表达分析造成极大阻碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用，所述荧光定量内参在美国白蛾不同种群密度条件下稳定表达，为不同种群密度下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据。

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因，所述荧光定量内参基因包括RPS26基因和/或RPS15基因；

所述RPS26基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述RPS15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种用于扩增所述美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因用引物，包括扩增RPS26基因用引物和/或扩增RPS15基因用引物；

所述扩增RPS26基因用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；

所述扩增RPS15基因用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物。

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量检测试剂盒，包括所述引物。

优选的，还包括SYBR Premix Ex Taq^TM II。