[发明专利]人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及微生物及核酸基因组检测领域，具体涉及提供利用等温核酸扩增技术对临床上一种常见的人类疱疹病毒(巨细胞病毒)核酸检测的引物组合和探针。本发明提供的引物组合与探针，特异性好，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及微生物及核酸基因组检测领域，特别涉及人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术

巨细胞病毒(Cytomegalvirus，CMV)是人类疱疹病毒家族中的双链DNA病毒，可引起原发性和复发性疾病，严重危害人类的生命和健康，特别是在免疫力低下和器官移植的患者中。巨细胞病毒感染与人类先天性疾病高度相关，易导致新生儿生长迟缓、神经性耳聋、先天性耳聋等疾病。CMV、人类疱疹病毒以及其他相关病毒都可以引起呼吸道疾病、神经性感染和传染性单核细胞增多症以及其他临床疾病。这些种病原体引起的疾病的临床症状非常相似。

目前，对CMV感染的病原学鉴定主要包括病毒培养、血清学检测和分子生物学检测。病毒培养是病原体诊断的金标准，但耗时长，样本要求质量高，不利于传染病的早期诊断；血清学检测也有一些缺点，如耗时长、窗口期不稳定。定量聚合酶链反应(QuantitativePolymerase chain reaction,qPCR)逐渐成为核酸检测的金标准。然而，高精度的复杂设备和专业人员在基层应用中难度较大，因此有必要开发一种简单、快速、方便、适用的核酸检测方法。

重组酶介导的等温核酸扩增技术(Recombinase-aided amplification，RAA)已被成功应用于2019年新型冠状病毒、乙型肝炎病毒、肠道病毒、人腺病毒、呼吸道合胞病毒、百日咳杆菌等病原体的检测，以及人类先天性心脏病的单核苷酸多态性分型。该技术在体外最适温度为37-42℃的条件下，利用反应体系中的大肠杆菌重组酶UvsX、单链结合蛋白、DNA聚合酶、缓冲液等反应组分，可在30分钟内实现目的基因的指数化扩增。整个过程包括引物和同源序列的紧密结合，以及链的延伸和互补。

内部质控(internal control，IC)包括竞争性内参(Competitive IC,CIC)和非竞争性内参(Noncompetitive IC，NCIC)，是核酸检测反应的一个重要的体系监控，在RAA反应中引入IC，实时监测整个RAA反应以此避免假阴性的出现。竞争性内参是目的基因和内部指控共享同一对正向和反向引物，在封闭的单管中分别引入特异的与靶序列和内参序列互补的探针，实时监测整个RAA反应系统。结果显示CIC为阳性时，表明结果可靠真实，而CIC为阴性时，指示结果失效，可能的原因是操作失误、温度不当、RAA反应体系混合物不正确、DNA聚合酶活性差或样品基质中存在抑制物质，从而导致了假阴性结果。非竞争性内参，是使用不同的引物对对靶基因和内部指控进行扩增，其来源于样本中的人类基因组，目的是对核酸提取到结果判读整个过程进行实时监控，不仅对扩增反应进行监控，还能够对样本采集质量和核酸提取质量进行解释。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了人类疱疹病毒(巨细胞病毒)的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用。本发明提供的引物组合与探针，特异性好，灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物探针组合，包括第一引物探针组合和/或第二引物探针组合；

所述第一引物探针组合为CIC组合，具有：

(I).上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和

(II).下游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和

(III).探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或

(IV).如(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或