[发明专利]一种利用三维荧光光谱检测黄素蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种基于三维荧光检测黄素蛋白的方法，属于酶蛋白检测领域。为了解决了在基因工程菌发酵的黄素蛋白粗酶液中杂蛋白影响黄素蛋白准确、快速和高灵敏度的定性目的蛋白的技术问题。本发明提供了一种利用三维荧光光谱检测黄素蛋白的方法，FAD/FMN为黄素蛋白中特异性辅酶，根据FAD/FMN三维荧光特征峰可以快速直观判断出粗酶液中黄素蛋白的存在，根据黄素蛋白中辅酶FAD/FMN荧光特征峰的荧光强度与蛋白浓度的线性关系，可以快速测量粗酶液中黄素蛋白浓度，为其他以蛋白快速检测分析提供借鉴。

技术领域

本发明涉及一种利用三维荧光光谱检测黄素蛋白的方法，属于酶蛋白检测领域。

背景技术

黄素蛋白是一类结合黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)或黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)辅酶的酶类，在机体内执行氧化还原、生物能量合成、生物降解、细胞凋亡、神经发育、生物合成等重要的生物学功能。例如肌氨酸氧化酶被广泛用于临床试验中肌酐水平的测定，在农业领域中可以加快N-甲基有机氮农药的生物降解，在食品领域用于检测葡萄酒样品中的有机酸；胆固醇氧化酶可用于临床样品中胆固醇含量的测定，还可用于生物催化获得甾体激素药物前体的制备。

黄素氧化酶的应用范围不断扩大，尤其在精细化学品生物合成领域中，相比化学法氧化还原的苛刻条件，黄素氧化酶具有高效、高选择性、条件温和等特点，是一类环境友好的生物催化剂，在化学品生物合成中越来越受到人们的青睐。研究黄素氧化酶可为其在医疗诊断和精细化工方面的应用提供技术支持。此外，黄素蛋白以FAD或FMN为辅基的蛋白，探讨辅基对黄素氧化酶蛋白催化性能的相互作用、酶蛋白分子结构的进化意义等，具有一定的理论价值。通用检测黄素蛋白的方法主要有考马斯亮蓝法或紫外检测，它们会随着样品中的蛋白种类和纯度的不同，存在结果特异性或灵敏度低的情况。尤其在黄素蛋白粗酶液样品测试中，黄素蛋白的特异性很低。

发明内容

本发明的目的是为了快速和准确的检测黄素蛋白，解决了在基因工程菌发酵的黄素蛋白粗酶液中杂蛋白影响黄素蛋白准确、快速和高灵敏度的定性目的蛋白的技术问题。

本发明提供了一种利用三维荧光光谱检测黄素蛋白的方法，所述方法的步骤如下：

利用三维荧光光谱技术获得待检测的样品溶液的三维荧光图谱，如果三维荧光图谱中有FAD或FMA的荧光特征峰，FAD或FMA在激发波长280-550nm范围和发射波长的450-650nm范围下具有荧光特征峰，则待检测的样品溶液含有黄素蛋白。

在一种实施方式中，所述黄素蛋白为肌氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶或芳香基醇氧化酶。。

在一种实施方式中，所述三维荧光光谱技术的条件为PMT电压为700V。

本发明还提供了一种利用三维荧光光谱技术定量黄素蛋白的方法，利用三维荧光光谱技术检测获得待测样品中黄素蛋白的三维荧光光谱，根据回归方程定量待检测的黄素蛋白。

在一种实施方式中，所述回归方程代表的是FAD荧光强度与黄素蛋白的浓度之间的线性关系。

在一种实施方式中，所述黄素蛋白为肌氨酸氧化酶。

在一种实施方式中，所述回归方程为I_F＝44.7+1674c，其中，I_F是FAD的荧光强度，c是肌氨酸氧化酶的浓度。

本发明还提供了上述检测黄素蛋白和定量黄素蛋白的方法在筛选或鉴定表达黄素蛋白的基因工程菌中的应用。

在一种实施方式中，所述基因工程菌为细菌或者真菌。所述细菌不限于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。所述真菌不限于酵母菌。

本发明还提供了上述检测黄素蛋白和定量黄素蛋白的方法在定性或定量在粗酶液中黄素蛋白含量中的应用。

有益效果：