[发明专利]一种培育不结球白菜小孢子植株的方法

说明书

本发明公开了一种培育不结球白菜小孢子植株的方法。该方法包括如下步骤：(1)取样及花蕾挑选；(2)小孢子培育：用次氯酸钠对花蕾消毒，灭菌水清洗2遍，1/2NLN‑13培养基润洗；润洗后的花蕾进行研磨、过滤、离心，黄绿色沉淀用NLN‑13培养基稀释并添加活性炭，加入褪黑素分装到35mm培养皿，33℃热激24h，暗培养10天形成胚状体；(3)植株再生：胚状体补光振荡培养后移到改良固体1/2MS培养基中培育50d，炼苗移栽。本发明所述方法在能够诱导部分难出胚品种出胚，提高易出胚品种出胚率，简化操作步骤缩短试验时间，提高再生植株存活率。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种培育不结球白菜小孢子植株的方法。

背景技术

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensisMakino)常被称为小白菜，为十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)，其口感好、食用价值高、生长周期短、适应性强，在我国各地均有种植，是我国重要的蔬菜作物之一。不结球白菜为常异花授粉作物，通过优良亲本杂交获得杂种优势的品系是常见的育种方法之一，因此如何获得稳定的纯合亲本对于不结球白菜种质创新工作意义重大。

游离小孢子培养技术(Isolated Microspore Culture，IMC)是指通过机械挤压花蕾的方式，分离小孢子，利用细胞全能性，培养成单个植株的过程。游离小孢子培养技术从培养到双单倍体(Doubled Haploid，DH)植株的获得仅需1～2年，大幅提升育种工作的效率。

1982年，德国科学家Lichter从甘蓝型油菜的花蕾中分离出小孢子，通过培养最终获得胚状体，为芸薹属作物游离小孢子技术发展奠定基础。之后，游离小孢子培养技术在青花菜、菜薹、菜心等芸薹属作物相继获得成功，这项技术日益成熟，逐渐发展成一套较为完善的体系。除芸薹属作物之外，游离小孢子培养技术在辣椒、萝卜、黄瓜、茄子等蔬菜作物以及玉米、水稻、小麦、大麦等粮食作物上也取得重大突破。国内研究游离小孢子培养虽然起步较晚，但是经过科研工作者的努力，已经取得显著的成果。1992年，曹鸣庆等首次对12个小白菜品种进行游离小孢子培养试验，一共有9个品种获得胚状体及再生植株。1993年，李岩等以小白菜的三个变种为试验材料，成功获得胚状体及其再生植株。随着国内外对游离小孢子培养技术研究的不断深入，已经初步建立了一些有效的小孢子培养体系。但小孢子胚胎发生机理尚不清楚，影响因素复杂，出胚率受基因型制约严重，污染问题一直存在。

发明内容

本发明主要是针对目前该技术操作繁琐，出胚率受基因型影响以及污染等问题进行改进，从而提供了一种高效简易的培育不结球白菜小孢子植株的方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种培育不结球白菜小孢子植株的方法，其特征在于具体包括如下步骤

(1)取样：在不结球白菜的盛花期，摘取不结球白菜花序，加入少量的无菌水保持花蕾湿润，放入4℃冰箱进行低温预处理24h；

(2)挑蕾：用镊子挑选不结球白菜的花蕾，从步骤(1)预处理后的花序中挑选饱满、无病虫害且长度在2～3mm之间的花蕾，放置于离心管中；

(3)花蕾消毒：向离心管中加入质量浓度为1％的NaClO溶液，震荡，弃去NaClO溶液，加入无菌水清洗，弃去无菌水，用1/2NLN-13培养基润洗；

(4)小孢子分离及纯化：取步骤(3)消毒后的花蕾加入1/2NLN-13培养基，研磨，过滤，离心，弃上清液，下层产物待用；

(5)小孢子稀释及分装：将步骤(4)所得下层产物用NLN-13培养基稀释，使混合液中小孢子浓度为1×10⁵～2×10⁵个/mL，优选的，使混合液中小孢子浓度为1×10⁵；

向混合液中加入活性炭溶液，使混合液中活性炭终浓度为1mg/mL；