[发明专利]一种清金化痰汤生物限值测定方法

权利要求书

1.一种清金化痰汤生物限值测定方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1、配制清金化痰汤水提物冻干粉溶液和LPS溶液，培养RAW264.7巨噬细胞；

步骤2、监测RAW264.7巨噬细胞接种密度与孵育时间的关系；

步骤3、监测清金化痰汤水提物冻干粉溶液对RAW264.7细胞活力的影响；

步骤4、测定基于RAW264.7巨噬细胞分泌功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；

步骤5、测定基于RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；

步骤6、数据处理，利用IBMSPSSStatistics19.0统计软件对实验数据进行统计学处理；

其中，步骤4具体包括以下步骤：

步骤A1、测试清金化痰汤水提物冻干粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6含量的影响；

步骤A2、测定清金化痰汤水提物冻干粉的的限值剂量；

步骤A3、进行重复性和方法适用性验证。

2.根据权利要求1所述的一种清金化痰汤生物限值测定方法，其特征在于，步骤2的具体方法为：

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为1×10⁵、3×10⁵、5×10⁵个/mL，接种于96孔板，100μL/孔，再加入100μLDMEM完全培养基，置于37℃、含5％CO₂培养箱内培养，分别于培养12h、24h、36h、48h、60h后加入20μLCCK-8，2h后在酶标仪450nm下测定其吸光度值。

3.根据权利要求1所述的一种清金化痰汤生物限值测定方法，其特征在于，步骤3的具体方法为：

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10⁵个/mL，接种于96孔板，100μL/孔，置于37℃、含5％CO₂培养箱内贴壁培养3h后，分为对照组、清金化痰汤水提物冻干粉组，终质量浓度为62.5、125、250、500、1000μg·mL^-1，各组3个复孔，给药后，于37℃、含5％CO₂培养箱培养24h，每孔加入20μLCCK-8试剂，2h后酶标仪450nm波长处测定其吸光度值，并计算增殖率＝(药物组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100％，试验重复3次。

4.根据权利要求1所述的一种清金化痰汤生物限值测定方法，其特征在于，清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度为62.5～250μg·mL^-1时促进RAW264.7细胞增殖。

5.根据权利要求1所述的一种清金化痰汤生物限值测定方法，其特征在于，清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度≥500μg·mL^-1时增强RAW264.7细胞吞噬功能。

6.根据权利要求1所述的一种清金化痰汤生物限值测定方法，其特征在于，清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度≥125μg·mL^-1抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌IL-6，或者≥500μg·mL^-1增强RAW264.7细胞吞噬功能，达到其中任何一项，作为生物活性质控指标。