[发明专利]促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法

说明书

本发明属于生物技术和遗传改良技术领域，公开了一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法，所述促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA是苹果中的Mdm‑miR160；所述促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA的鉴定方法包括：RNA提取和反转录；基因克隆；苹果遗传转化；干旱胁迫处理；原位杂交；微嫁接；烟草嫁接番茄；数据分析。本发明提供的促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA是苹果中的Mdm‑miR160，可以从接穗移动到砧木，促进砧木的根系发育，从而提高苹果的抗旱性。本发明通过苹果遗传转化，获得过量表达的转基因株系，表型分析发现，Mdm‑miR160e OE表现出矮化症状。

技术领域

本发明属于生物技术和遗传改良技术领域，尤其涉及一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法。

背景技术

目前，植物已经进化出动态和复杂的细胞间通讯网络，协调和适应它们的生长和发育以适应各种环境变化。除了蛋白质和RNA等大分子外，代谢产物和植物激素等小分子也在植物中起信号传递的作用。作为信号分子RNA可以通过胞间连丝在细胞间局部移动，也可以通过韧皮部长距离移动来发挥生物学功能。非细胞自主RNA可作为植物生长发育、营养分配、基因沉默、抗病毒防御和胁迫响应等多种生理过程的移动信号，对植物体内的潜在调控机制具有重要的生物学意义。

miRNAs是一类内源性的非编码调节RNA，由RNA聚合酶II转录产生初级miRNAs(pri-miRNAs)。在植物中通过DICER-LIKE 1(DCL1)剪切处理大多数的pri-miRNAs，随后相互作用蛋白SE、HYL1和CBC剪切pri-miRNA形成短的双链miRNA，包括一个成熟miRNA和一个信使miRNA链，大约20-24个核苷酸长度。研究表明成熟的miRNAs通过形成RNA诱导的沉默复合体与靶标mRNA结合，从而对靶基因起到负调控作用。在拟南芥中，miR160的靶基因是生长素反应因子(ARF10、ARF16和ARF17)，共同调控植物的生长发育多个方面。然而苹果Mdm-miR160介导的ARF17在干旱响应中的功能尚未有研究报道。因此本发明通过遗传转化获得了苹果Mdm-miR160e的转基因株系，并对Mdm-miR160介导的苹果抗旱性进行了深入的研究。

研究报道一些miRNAs可以作为细胞间信号，进行短距离移动或长距离移动。有一些miRNAs可以在植物内部发生运动，这些miRNAs主要集中在韧皮部的分泌物中，通过营养物质的有效传递进行长距离的移动。但现有技术中关于miRNA移动后促进砧木根系发育及抗旱的相关技术方案尚未见报道。

嫁接是研究miRNA移动的主要手段。目前嫁接已被广泛应用于促进苹果的开花、矮化和抗逆等方面。因此，亟需一种促进砧木根系发育及抗旱的基因及鉴定方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：一，现有技术大部分是通过嫁接后韧皮部汁液测序分析、原位杂交、stem-loop RT-qPCR，突变体筛选以及Northern blot等方法研究miRNA的移动，以上实验可以发掘新的可移动miRNAs，但miRNAs移动后发挥的生物学功能研究报道较少。二，miRNA在加工生成过程中会发生两次剪切，因此不能连接荧光标签(如GFP)准确可视化miRNAs的移动过程。三，异源物种嫁接成功率较低，并且miRNA家族在不同的物种间十分保守，这给miRNA移动的实验验证带来不便。

解决以上问题及缺陷的难度为：miRNA与水分子和其他离子不同，在组织间的运输不是循环进行的，因此需要更多的实验来确定可移动的物种和决定一个miRNA是否可移动的特征。miRNAs随着韧皮部汁液的运输而发生移动，验证miRNA及其活性的动态可视化方法对于提供miRNA移动的最终证据至关重要，还需要进一步探索和创新。miRNA介导的细胞和器官间的信号转导机制和调控机制研究较少。为了充分理解可移动miRNA的作用，确定不同家族成员的表达模式、定位和功能，以及阐明不同家族成员是否具有不同的移动性需要更多的研究支持。