[发明专利]一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法

权利要求书

1.一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：选择存活率高且产量高的水稻通过多代自交，获得纯化的亲本1，选择具有抗冷性的水稻通过多代自交，获得纯化的亲本2；

S2：采用CTAB法提取亲本2的DNA；

S3：采用限制性内切酶对S2中提取的DNA进行酶切，获取酶切的亲本2的DNA；

S4：通过花粉管道法将S3中获取的酶切的亲本2的DNA导入亲本1，通过亲本1结穗，获得F1代种子；

S5：将F1代种子分为实验组和对照组，将实验组的F1代种子种植在控温箱内，通过控制控温箱内的温度，对实验组种植的F1代进行冷处理，同时将对照组的F1代种子种植在大棚内，分别记录实验组与对照组的存活率，并获取实验组存活的F1代的种子，得到F2代种子；

S6：将F2代种子分为实验组和对照组，将实验组的F2代种子种植在控温箱内，通过控制控温箱内的温度，对实验组种植的F2代进行冷处理，同时将对照组的F2代种子种植在大棚内，分别记录实验组与对照组的存活率，并获取实验组存活的F2代的种子，得到F3代种子；

S7：将F3代种子分为实验组和对照组，将实验组的F3代种子种植在控温箱内，通过控制控温箱内的温度，对实验组种植的F3代进行冷处理，同时将对照组的F3代种子种植在大棚内，分别记录实验组与对照组的存活率，并获取实验组存活的F3代的种子，得到F4代种子；

S8：将F4代种子分为实验组和对照组，将实验组的F4代种子种植在控温箱内，通过控制控温箱内的温度，对实验组种植的F4代进行冷处理，同时将对照组的F4代种子种植在大棚内，分别记录实验组与对照组的存活率，并获取实验组存活的F4代的种子，即可得到耐冷性强存活率高且产量高的水稻品种。

2.根据权利要求1所述的一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：所述的育种方法中步骤S2具体为：

a：将亲本2的新鲜叶片叶脉去掉，剪碎置于研钵中，加入液氮快速研磨成粉末状，转入2mL离心管，加入65℃预热的CTAB提取液900uL充分混匀，65℃保温40-60min；

b：将步骤a中的离心管内加入等体积的体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液轻轻摇动混合然后离心；

c：获取步骤b中的上层清液，加入CTAB缓冲液与体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液，混合后离心；

d：获取步骤c中的上清液，中加入异丙醇，混合后离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；

e：获取步骤d中的上清液中加入异丙醇，混合后离心，得到的沉淀用双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％冷乙醇，放入-20℃冰箱中沉淀2h后离心；

f：挑出成团的DNA用无水乙醇洗一次，自然干燥后，用无菌水溶解，加入RNA酶贮存缓冲液溶解处理后，放置8小时，获得亲本2的DNA。

3.根据权利要求1所述的一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：所述的育种方法中步骤S3中，用限制性内切酶酶切获得的亲本2的DNA，酶切后的DNA用冷乙醇-20摄氏度下放置8小时，然后离心，得到的沉淀干燥后用1倍柠檬酸钠缓冲液溶解，获得酶切的亲本2的DNA。

4.根据权利要求1所述的一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：所述的育种方法中步骤S3中，获得的酶切野生菰DNA溶液的浓度为120-180μg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：所述的育种方法中步骤S4中，花粉管道法实施前需要将亲本1单独移栽，防止花粉对DNA导入产生影响。

6.根据权利要求1所述的一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：所述的育种方法中步骤S4中，花粉管道法需要在亲本1开花1-2h内，切除亲本1的柱头，然后往柱头滴入酶切的亲本2的DNA。

7.根据权利要求1所述的一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：所述的育种方法中步骤S5中，实验组存活下来的F1需要通过自交授粉，获得F2代种子。

8.根据权利要求1所述的一种用于提高水稻耐冷的分子育种方法，其特征在于：所述的育种方法中步骤S5中，F2代种子需要选用正常时间段结穗的F1的种子。