[发明专利]一种芋螺毒素有关杂质的检测方法

说明书

本发明涉及一种芋螺毒素有关杂质的检测方法。主要解决现有缺少对芋螺毒素杂质分析方法的技术问题。本发明检测方法，包括以下步骤：（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到试品溶液；（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到对照品溶液；（3）以C18键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用乙腈和缓冲液为流动相，梯度洗脱；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；进样体积为20μl；柱温为45℃。本方法有效地解决了芋螺毒素有关杂质检测和分离的问题，能保证芋螺毒素中有关杂质的可控性，提高产品质量。

技术领域

本发明涉及一种多肽分析检测方法，特别涉及一种芋螺毒素有关杂质的检测方法。

背景技术

芋螺毒素(CTX)，结构式如下：

由海洋腹足纲软体动物芋螺的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物。每种芋螺的毒液中可能含50～200个活性多肽。不同种芋螺所含活性肽各不相同，理论上估计有5万多种不同活性肽存在于芋螺毒液中。芋螺毒素多数由10～40个氨基酸残基组成，富含两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，可作用于各种离子通道和受体的类型及亚型，是一种新型的天然麻醉剂。

对于以往芋螺毒素活性环肽的人工合成中，由于其结构复杂，人工合成的产率较小，纯度也低，合成的中间肽还需氧化折叠才能形成正确的构象。在合成过程中，为了更好的控制产品质量，须对杂质进行准确的分析。现有技术中，缺少对芋螺毒素杂质分析报道。

发明内容

本发明目的是提供一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，主要解决目前缺少芋螺毒素分析检测方法的技术问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，包括以下步骤：

（1）称量芋螺毒素样品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml供试品溶液；

（2）称量芋螺毒素对照品，加入分析检测水稀释液，定容得到2mg/ml对照品溶液；

（3）以C18键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用乙腈和缓冲液为流动相，梯度洗脱 ；检测波长为215nm ；流速为1 .0ml/min；进样体积为20μl；柱温为45℃。

所述缓冲液为三乙胺溶液。三乙胺溶液质量百分浓度为0.05%-0.1%，优选质量百分浓度0.05%。三乙胺缓冲液pH为2.5-4，pH值优选为2.5。

所述洗脱梯度为乙腈质量百分比12-14%。

洗脱后得到芋螺毒素杂质为：

IMP1序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRRITDACV；

IMP2序列为：RSSGRYCRSPYDRRRRYCRRIITDACV；

IMP3序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDCVV；

IMP4序列为：TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRIITDACV。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种芋螺毒素有关杂质的检测方法，该方法能将可能的降解杂质和工艺杂质与主成分有效分开，且灵敏度高，可应用于芋螺毒素的质量控制，有利于提高产品质量。常规检测方法很难检测缺失一个或者多一个氨基酸杂质，本发明可以有效解决检测问题，特别是对杂质IMP1和IMP4有很好的分离效果。

附图说明

图1为芋螺毒素样品检测局部放大图。

图2为实例1的空白溶液HPLC图。

图3为实例1的对照溶液第一针HPLC图。

图4为实例1的对照溶液第二针HPLC图。