[发明专利]融合蛋白及靶向CD19的CAR及其应用

说明书

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种融合蛋白及其靶向CD19的CAR及其应用。所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，包含胞外段、跨膜结构和胞内信号区。该融合蛋白和靶向CD19的CAR结构连接共同或单独转染免疫细胞,该免疫细胞在缺氧环境下活性增强，而且以逆转肿瘤微环境，破除肿瘤组织中抑制性信号对CAR‑T功能的影响，实现了CAR‑T治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。

技术领域

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种融合蛋白及靶向CD19的CAR及其应用。

背景技术

CAR-T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB，CD28，ICOS(CD278)。CAR分子包含的ScFv对肿瘤抗原具有特异性识别的特点，通过铰链区和跨膜区进行T细胞激活细胞传递。目前临床上CAR-T治疗主要运用于血液瘤系统的肿瘤治疗。

CAR-T疗法虽然在血液系统瘤中取得较好的成绩，但CAR-T在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其原因一方面因为CAR-T较难进入实体瘤内部，一方面即便CAR-T细胞进入实体瘤内部也因为肿瘤微环境而不能正常发挥功能，这些都影响CAR-T细胞在实体瘤治疗的疗效；并且由于实体瘤异质程度高，实体瘤靶点往往在正常组织也有所表达，因此还存在脱靶风险等安全问题。虽然目前有构建第四代CAR、有构建双CAR(构建带有双抗原的CAR-T)或带有激活抑制功能的iCAR的结构以期望提高肿瘤CAR-T治疗的有效性和安全性，但这些CAR结构仍存在安全性或较难被激活的问题。总之CAR-T疗法目前较多研究为血液瘤治疗，实体瘤微环境较为复杂，如肿瘤微环境、肿瘤异质性等特点，使CAR-T疗法的应用受到局限，因此，构建一种在肿瘤微环境中特异启动活化的CAR结构很有必要。酸性和缺氧是肿瘤微环境中的两大物理因素，肿瘤中的大部分的细胞都处在缺氧的环境中，而缺氧改变了肿瘤细胞的糖代谢途径，产生大量的乳酸，造成肿瘤微环境中酸性的特征，而这些酸性可以降低肿瘤细胞凋亡，增强细胞的增殖和生长，并且帮助肿瘤细胞的迁移。缺氧在实体瘤微环境研究比较清楚，如果可以设计在缺氧条件下被激活的可调控启动子，就可以达到在肿瘤微环境中特异性激活下游蛋白的表达从而提高CAR-T细胞的有效性和安全性的目的。另外信号调节蛋白α(SIRPα)是CD47的配体之一，可与CD47结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用，目前绝大多数关于CD47的研究均集中于SIRPα。SIRPγ也可与CD47结合，其存在于T细胞表面，胞外区由一个V结构域和两个C1结构域组成，无胞内信号，仅通过CD47传递单向信号，目前很少有研究者针对SIRPγ进行改造，并且CD47作为继PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫检查点，通过向巨噬细胞传递“不要吃我”信号，抑制固有免疫的进行。目前有文献报道采用靶向CD47 ScFv制备CAR-T进行肿瘤治疗。CD47可以促成肿瘤逃逸的免疫微环境，不过由于肿瘤的异质性，单独靶向CD47疗效有限，并且外源的ScFv由于其强的亲和力可能会导致CAR-T细胞过度活化存续性差和非特异性引起安全隐患。因此，采用更安全有效的方案去识别CD47破除肿瘤微环境的逃逸信号十分重要。

CD19是B细胞表面的跨膜蛋白(Cluster of differentiation 19protein，CD19)，它与B细胞活化、信号传导及生长调节密切相关，是B淋巴细胞表面特异性表达的一种功能受体分子，参与B细胞抗原受体(BCR)识别抗原和B细胞内Ca2+的转运，调节B细胞的活化与增殖。CD19作为重要的分子标记物，可用于白血病、淋巴瘤及免疫系统疾病的诊断和预后判断。CD19作为靶点的治疗有效性好，安全性高。已有多项临床研究，探索利用CAR-T治疗CD19阳性B细胞恶性肿瘤。但是由于肿瘤微环境的影响，CAR-T在实体瘤的治疗效果有限。虽然目前靶向CD19的CAR-T制品在治疗淋巴细胞白血病上效果显著，但在治疗淋巴瘤上效果有限，构建一种针对肿瘤微环境的CAR-T细胞制品用于淋巴瘤的治疗很有必要。

发明内容