[发明专利]一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用。以pGAPZα‑A质粒为模板PCR扩增获得启动子GAP基因片段；将扩增的启动子GAP基因片段通过双酶切后，连接到pGAPZα‑A‑NKt2上，构建pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组载体；将pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组载体通过电转化毕赤酵母X33中，获得双启动子系统重组基因工程菌LNF013。本发明成功构建双启动子毕赤酵母真核体系表达的纳豆激酶重组基因工程菌，纳豆激酶表达量及酶活性显著提高，为今后纳豆激酶大规模的应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体涉及一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌komagataella phaffii LNF013的构建。

本发明中所称的一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌，komagataella phaffii LNF013，已于2021年3月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.22081。

背景技术

纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis varnatto)产生的碱性丝氨酸蛋白酶，经研究发现，纳豆激酶具有很好的溶解纤维蛋白(血栓的主要成分)能力。

纳豆激酶比市面上其他治疗血栓的药物，更具有安全、高效、价廉、易得等优点，未来前景十分广阔。然而纳豆激酶在原核表达体系中表达时，表达蛋白不纯且易形成包涵体，不易分离目的蛋白；而在真核体系中表达时，表达量又较低，限制其进一步应用，所以获得纯度高，产量又高的纳豆激酶成为其扩大工业化生产的重中之重。鉴于纳豆激酶功效及发展前景，急需构建一种高效表达纳豆激酶的基因工程菌。

发明内容

本发明的目的是构建一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌。

本发明采用的技术方案是：一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌，为komagataella phaffii LNF013，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.22081。

一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的构建方法，方法包括如下步骤：

1)GAP启动子基因片段的获得：

以pGAPZα-A质粒为模板，以Primer5和Primer6为引物，通过PCR反应，获得两端添加酶切位点Kpn I和Not I的GAP启动子基因片段；

Primer5：GGGGTACCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC

Primer6：ATAAGAATGCGGCCGCATAGTTGTTCAATTGATTGAA

2)pGAPZα-A-NKt2载体质粒的获得：

以pGAPZα-A-NKt2为模板，以Primer7和Primer8为引物，通过环PCR扩增，获得在pGAPZα-A-NKt2下游两端添加酶切位点Kpn I和Not I的pGAPZα-A-NKt2载体质粒；

Primer7：ATAAGAATGCGGCCGCTTCGAAACGATGAGATTTCCT

Primer8：GGGGTACCATAGTTGTTCAATTGATTGAA

3)构建pGAPZα-A-GAP-GAP-NKt2重组表达载体：