[发明专利]一种基于单色多重荧光定量PCR的鉴别良恶性肺结节的方法

权利要求书

1.一种基于单色多重荧光定量PCR的鉴别良恶性肺结节的方法，包括用于多重荧光PCR检测的上、下游引物以及探针；其特征在于，上、下游引物分别为ADGRB1-F/R、CNTNAP2-F/R、DIP2B-F/R、LONRF2-F/R，探针分别为ADGRB1-probe、CNTNAP2-probe、DIP2B-probe、LONRF2-probe，内参基因β-actin上、下游引物分别为β-actin-F/R，探针为β-actin-probe；

上、下游引物序列具体如下：

ADGRB1-F(SEQ ID No.1)：5’-GACAGTGCACTTTCTTCC-3’

ADGRB1-R(SEQ ID No.2)：5’-CAGGTTCCTGTAGAGCAC-3’

CNTNAP2-F(SEQ ID No.3)：5’-GGCTAGGAAAGGGAAATC-3’

CNTNAP2-R(SEQ ID No.4)：5’-GATGCAGAAGATGGATGA-3’

DIP2B-F(SEQ ID No.5)：5’-GGAAGGGAAGAAAAGATAAATATC-3’

DIP2B-R(SEQ ID No.6)：5’-GCTCTGCCTCAATCAGTA-3’

LONRF2-F(SEQ ID No.7)：5’-CAGAGACAAGGAAACAGA-3’

LONRF2-R(SEQ ID No.8)：5’-TGGCTTAAAACAACACATA-3’

β-actin-F(SEQ ID No.13)：5’-TAGGCACACACTTCCAAG-3’

β-actin-R(SEQ ID No.14)：5’-TGGCTCATGCCTGTAATC-3’

探针序列具体如下：

ADGRB1-probe(SEQ ID No.9)：5’FAM-CACCACAAACACGGATGCTTCA-3’BHQ1

CNTNAP2-probe(SEQ ID No.10)：5’FAM-AAGTACCTGGTTCATCGCACTG-3’BHQ1

DIP2B-probe(SEQ ID No.11)：5’FAM-TTGCAGCCAGAATGTAGCCTT-3’BHQ1

LONRF2-probe(SEQ ID No.12)：5’FAM-CACAACCTCCAAAGAGAAACGCAT-3’BHQ1

β-actin-probe(SEQ ID No.15)：5TexasRed-AATTATCTGTAGAGGTATGGCTTCTCACC-3’BHQ2。

2.一种包括权利要求1所述的基于单色多重荧光定量PCR的鉴别良恶性肺结节的方法，其特征在于，检测步骤如下：

S1、提取血浆游离DNA；

S2、通过葡糖基转移酶T4-β-GT，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；

S3、在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素；

S4、将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；

S5、利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的DNA片段；

S6、将结合在链霉亲和素免疫磁珠上的DNA洗脱下来，作为模板；

S7、对上述DNA进行多重荧光定量PCR扩增；

S8、收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，选择内参基因β-actin为参照，对待测样品进行编板设置；

S9、待测样品荧光扩增曲线呈现良好的对数增长，进行结果分析。

3.根据权利要求2所述的一种基于多重荧光定量PCR技术的鉴别良恶性肺结节的方法，其特征在于，在S3中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素。

4.根据权利要求2所述的一种基于多重荧光定量PCR技术的鉴别良恶性肺结节的方法，其特征在于，在S4中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。