[发明专利]用于检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及方法

说明书

本发明公开了用于检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组，该引物组能够特异性扩增溶血性曼氏杆菌的lktC基因，所述引物组包括2条内引物、2条外引物和1条环引物，各引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1‑5所示。本发明还公开了基于所述LAMP引物组建立的溶血性曼氏杆菌非诊断目的检测方法，该方法可根据颜色变化进行结果判定，不依赖于复杂的仪器，具有反应时间短，操作简单，检测敏感性、特异性高等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测溶血性曼氏杆菌的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物及方法。

技术背景

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.h)是引起牛羊等反刍动物呼吸疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRD)的病原之一，当运输、环境等应激或其他病原协同感染导致宿主抵抗力下降时，病原侵袭肺部引起疾病发生，对牛场养殖造成巨大的损失。尽管较多血清型菌株均能引起发病，但从全球感染溶血性曼氏杆菌的动物来看，A1、A2和A6血清型占主导地位，A1和A6血清型主要感染牛，而A2血清型主要感染羊。有研究表明白细胞毒素(Leukotoxin,LKT)亚单位疫苗可以有效提高免疫保护力。

已有的溶血性曼氏杆菌的诊断方法主要为实验室进行细菌培养、PCR、多重PCR和PCR-ELISA等方法。这些方法对实验条件的要求、检测时间能及本身的灵敏度等方面均具有一定的局限性。因此，临床上急需一种高灵敏度和特异性、操作简单快速和能在现场检测的方法来弥补现有方法的不足。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种具有灵敏、特异、快速、简单、成本低等优点的核酸扩增方法。在溶血性曼氏杆菌检测方面，已有使用LAMP方法进行检测的报道(CN 108660192 A)，该方法针对溶血性曼氏杆菌gcp基因设计引物，进行环介导等温扩增并根据实时浊度仪进行结果判定，能够检测到0.855×10^-4ng/μL的gcp基因重组质粒，然而对病毒的检测灵敏度仍较低。

另外，浊度检测需要电脑和浊度仪等特殊的仪器，而且浊度的测定有一定的误差，不利于现场的操作。因此本研究的目的是在现有环介导等温扩增的基础上，基于溶血性曼氏杆菌保守基因lktC设计引物，建立一步法可视化LAMP方法，用于提高溶血性曼氏杆菌的检测灵敏度和便利性。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物及方法，旨在提高溶血性曼氏杆菌的检测灵敏度和便利性。

为了实现上述目的，本发明针对溶血性曼氏杆菌的lktC基因，设计了用于检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组，该引物组能够特异性扩增溶血性曼氏杆菌的lktC基因(SEQID No.6)，所述引物组包括2条内引物、2条外引物和1条环引物，核苷酸序列如下：

内引物：FIP:5'–TTGTTGCAGCAGGGCAGGAGCGACCAGTTAGATAACCATAGCG-3'(SEQ IDNo.1)

内引物:BIP:5'–AACCAGAGCGGTGGCCTCTAAGGTGGTGTTGTTACGACTG-3'(SEQ IDNo.2)

外引物:F3:5'-CAATCGCATCCGGGCTAA-3'(SEQ ID No.3)

外引物:B3:5'-TCCGGTACGGTTCAGCAA-3’(SEQ ID No.4)

环引物:LB:5'-CATCGTCTTCCGGCACAA-3'(SEQ ID No.5)