[发明专利]一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其应用

说明书

本申请提供了一种分离的能够特异性结合κ‑卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。所述的结构域PpCBM自身不具备酶活力，但与κ‑卡拉胶酶PpCgkCD共同作用可以显著提高PpCgk的比酶活，使其具有更强的底物亲和性和更高的相对催化效率。本申请公开了所述结构域PpCBM的制备方法以及其在构建工程菌株和降解κ‑卡拉胶中的应用。采用所述的结构域PpCBM构建的κ‑卡拉胶工程酶，不但显著增强了水解活性、提高了温度稳定性，而且将水解模式限定进行性水解，在产业发展中具有广阔的应用前景。此外，所述的结构域PpCBM单独也能用于促进κ‑卡拉胶底物的降解。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种碳水化合物结合结构域，具体涉及一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其制备和应用。

背景技术

卡拉胶(Carrageenan)是从麒麟菜、石花菜、鹿角菜等海洋红藻细胞壁中提取的硫酸化多糖，已经在食品及医药工程方面得到了广泛的应用。卡拉胶是由交替的D-半乳糖和3,6-内醚-D-半乳糖单元组成线性骨架，骨架由交替的β-1,4和α-1,3糖苷键连接，并含有一定比例的硫酸酯盐。根据3,6-内醚-D-半乳糖的含量以及酯类硫酸盐基团的数量和位置，常见的卡拉胶包括κ-卡拉胶、ι-卡拉胶及λ-卡拉胶。其中，κ-卡拉胶是由β-(1→3)-D-半乳糖-4硫酸基和α-(1→4)-3,6-内醚-D半乳糖交替连接而成的硫酸多糖。κ-卡拉胶寡糖在生理学和病理学研究中的生物活性引起了广泛关注，其具备包括抗凝、抗血栓、抗炎、抗病毒、抗肿瘤在内的多种功效，已逐渐成为药物和功能性食品研究与开发的热点。近年来，κ-卡拉胶寡糖在生物体抗氧化和自由基的清除方面也发挥着重要的作用。降解κ-卡拉胶得到的κ-卡拉胶寡糖不仅在黏度上大幅度降低，而且更容易被机体吸收利用，有望在不久的将来成为海洋糖类药物资源库的重要来源。

目前最常见的降解κ-卡拉胶的方法包括酸水解法与酶水解法。然而，酸水解法存在以下问题：(1)反应条件剧烈、产物聚合度较难控制；(2)寡糖末端的3,6-内醚-半乳糖在酸性条件下不稳定，往往导致产物结构被破坏。而酶水解法则具有产物纯度高、重复性好以及水解过程绿色无污染等优势，因而逐渐受到青睐。κ-卡拉胶酶特异性作用于κ-卡拉胶的β-4-硫酸-D-半乳糖和α-3,6-内醚-D-半乳糖之间的β-1,4-糖苷键，最终产物为硫酸κ-新卡拉寡糖。目前，研究人员已经发现了若干微生物κ-卡拉胶酶基因，但关于κ-卡拉胶工程酶构建的相关研究却鲜有报道。

碳水化合物结合结构域(Carbohydrate Binding Module，简称CBM)，是一类天然存在于碳水化合物活性酶中的、对碳水化合物具有结合能力的独立结构域。研究发现，许多多糖水解酶，尤其是不溶性多糖水解酶具有CBM。CBM本身不具有明显水解活性，但通过其与底物的特异性结合，提高了底物周围相对酶的浓度，定向引导底物接近酶催化区，同时还破坏了多糖底物结构，从而有效促进了酶与底物的缔合，显著提高多糖水解酶的水解活性。目前，CAZY数据库中已报道的CBM蛋白家族共有81个。根据结构和功能的相似性，CBM可以分为三类，即Type-A(与不溶性多糖表面结合的CBM),Type-B(与糖链结合的CBM),Type-C(与糖分子结合的CBM)。但是，目前尚未有特异性结合κ-卡拉胶的CBM结构域的报道。

发明内容

针对现有技术中κ-卡拉胶工程酶构建研究较少的现状，本申请提供了一种分离的能够特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM。采用所述的结构域PpCBM构建的κ-卡拉胶工程酶，不但显著增强了水解活性、提高了温度稳定性，而且将水解模式限定进行性水解，在产业发展中具有广阔的应用前景。

本发明的技术方案：

一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，所述结构域PpCBM的氨基酸序列选自如下(1)、(2)或(3)：

(1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；