[发明专利]使用CHO细胞高效发酵生产rhCG的方法

说明书

本申请提供了一种使用CHO细胞表达重组rhCG的补料培养发酵方法，包括在发酵混合培养基中加入氯化锰，或者在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。本申请还提供了所述方法用的相应培养基。

技术领域

本申请属于蛋白领域和细胞培养领域，具体地，本申请提供了使用CHO细胞高效发酵生产rhCG的方法及其相应培养基。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(hCG)由胎盘滋养细胞合成的激素，由α亚基、β亚基组成，目前广泛用于治疗女性不孕、性机能障碍、流产、侏儒症、皮肤瘙痒、皮痒、肿瘤等疾病。

hCG最早以孕妇尿液为原料，通过沉淀、离子交换层析等方法制备，含较多杂质、来源不确定、有传染疾病风险以及批间差异、易发生过敏反应等，在临床使用中存在风险。之后研究者把研发重点放在了利用重组技术制备和生产，并在临床上逐渐取代尿源HCG。

虽然有昆虫细胞、神经细胞等宿主的尝试，但目前rhCG生产中最常用的细胞仍然为为CHO细胞。但CHO细胞中蛋白质的表达调控机理、蛋白质翻译后修饰调控系统、细胞生长代谢调控机制等环节仍然缺少深入认识，所以在外源基因的整合策略、高表达菌株的筛选、高效培养基配置、培养工艺调控等方面的理论指导水平都还比较低，相关研究都更多地依赖大量的优化筛选和优化实验来获得较优的操作条件。不仅研究和生产效率低、耗时长、成本高，而且受偶然性因素影响较大。虽然国外先进企业已经通过开发谷氨酰胺合成酶(GS)系统、定制无血清个性化培养基、优化高密度微载体培养工艺和补料策略、应用低成本和低剪切力生物反应器等手段，rhCG的高水平表达仍然需要较长的培养时间(＞20天)和较高的生产成本。

因此，本领域中仍然有进一步改进CHO细胞生产rhCG技术的需求。

发明内容

前期对发酵参数和细胞等因素的优化后，我们尝试了对发酵混合培养基和补料培养基的改进，研究了多种特殊添加剂对CHO表达rhCG的影响，发现在培养基中加入锰离子、氢化可的松和焦磷酸钠可以有效提高rhCG表达水平。

一方面，本申请提供了一种使用CHO细胞表达重组rhCG的补料培养发酵方法，包括在发酵混合培养基中加入氯化锰，或者在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。

进一步地，加入的氯化锰浓度为3mg/ml，加入的氢化可的松和焦磷酸钠浓度为0.05mg/ml和3mg/ml。

进一步地，发酵时间为12日。

进一步地，将密度1.5*10⁶cells/ml以上的细胞接种20L到提前一夜已经预培养的50L发酵混合培养基里，接种完的当天，定为第一天，在培养第3、6、9天时分别加入10L补料培养基。

进一步地，培养参数为：36.5±1℃、pH控制在6.8-7.2、溶氧控制在20-70％，转速控制在60±5转/分。

另一方面，本申请提供了一种CHO细胞表达重组rhCG用培养基，包括发酵混合培养基和补料培养基，其中发酵混合培养基中加入了氯化锰，或者补料培养基中加入了氢化可的松和焦磷酸钠。

进一步地，加入的氯化锰浓度为3mg/ml，加入的氢化可的松和焦磷酸钠浓度为0.05mg/ml和3mg/ml。

另一方面，本申请提供了氯化锰、氢化可的松和/或焦磷酸钠在制备CHO细胞表达重组rhCG用培养基中的应用。

进一步地，培养基中氯化锰浓度为3mg/ml，氢化可的松和焦磷酸钠浓度为0.05mg/ml和3mg/ml。

附图说明

图1为CHO细胞发酵生产rhCG的基本流程。

图2为发酵培养第6日时hCG各亚基的相对丰度。

具体实施方式