[发明专利]一种用于定量检测单个活细菌粘附行为的原位测试系统和测试方法

权利要求书

1.一种用于定量检测单个活细菌粘附行为的原位测试方法，其特征在于，基于一种用于定量检测单个活细菌粘附行为的测试系统实现，所述系统包括电磁屏蔽箱、电化学工作站、计算机、设于电磁屏蔽箱内的减震台、以及设于减震台上的原子力显微镜和光学倒置显微镜；所述的原子力显微镜AFM包括AFM基盘和AFM扫描器；所述电磁屏蔽箱接地，用于消除周围环境中的电子干扰；所述减震台用于消除地面和桌面的震动对于测试过程的影响；

所述光学倒置显微镜的载物台上设有环境腔，所述环境腔为透明石英玻璃管状体，其上边缘与AFM基盘连接；所述环境腔设有进气管和出气管，用于调节环境腔内的气体氛围；AFM扫描器固定安装于所述AFM基盘的中心圆孔处；所述AFM扫描器正上方设有光源、AFM光学显微镜和摄像头，用于透过AFM扫描器中间透镜从上往下观察小球探针位置和激光位置；所述环境腔内设有样品台，所述样品台上开有圆孔，供光学倒置显微镜观察；所述样品台上设有原位电解池，所述原位电解池内放有活细菌和细菌培养液；所述样品台可进行上下、左右、前后方向的移动；所述AFM扫描器中安装有探针，所述探针的尖端小球外表面设置聚多巴胺层，用于抓取单个细菌；所述的原位电解池与电化学工作站相连；所述电化学工作站用于控制不同的原位测试条件，并检测细菌和原位电解池内的工作电极之间的电流信号；所述的光学倒置显微镜用于从下往下观察原位电解池底部，确定细菌和小球探针相对位置，从而配合原子力显微镜调整小球探针和样品台的运动，从而实现单个活细菌的抓取和力曲线测试；所述的计算机用于设置实验参数并记录实验数据；

所述的原位电解池包括池底和池壁，所述池底和池壁之间采用O形圈密封；所述池底为阳极键合玻璃，池底上设有工作电极和对电极，所述池壁上设有参比电极，池壁上还设有通气管；

所述的测试方法为：在光学倒置显微镜的辅助下，控制样品台前后、左右、上下移动，然后采用AFM扫描器中安装的探针抓取单个活细菌，然后继续控制样品台前后、左右、上下移动，使得抓有细菌的探针位于工作电极正上方，设置原子力显微镜及电化学工作站的参数；设置好参数之后点击运行，即可得到细菌和电极表面的力曲线和计时电流曲线；测试过程中，停止向原位电解池内鼓气，继续向环境腔内鼓气，以防空气进入；

通过对测试得到的力曲线进行定量分析和数值模拟，即可得到细菌和电极表面之间最大粘附力、膜外蛋白生物大分子链长度、平均展开事件次数和平均展开力；通过计时电流曲线可以得到细菌和电极之间的电流信号；

通过计算力曲线中所有锯齿状部分波谷纵坐标平均值，得到膜外蛋白生物大分子链的平均展开力；通过计算力曲线中锯齿数目平均值，得到膜外蛋白生物大分子链平均展开事件次数；根据蠕虫链模型进行数值模拟计算，得到膜外蛋白生物大分子链的平均长度，具体为：

其中，F为展开力大小；z为细菌和电极表面之间的距离；k_B为玻尔兹曼常数；T为测试温度；L_c为伸直长度，代表膜外蛋白生物大分子链长度；L_P用来描述膜外蛋白生物大分子链的柔性。

2.根据权利要求1所述的用于定量检测单个活细菌粘附行为的原位测试方法，其特征在于，在所述池底上，所述对电极为圆弧状，工作电极位于圆弧内；利用导电银漆将工作电极引线、参比电极引线和对电极引线接到原位电解池相应的接线点上，并将引线连接到电化学工作站。

3.根据权利要求1所述的用于定量检测单个活细菌粘附行为的原位测试方法，其特征在于，所述的对电极和工作电极是在池底表面蒸镀一层钛，然后再在钛层上蒸镀一层金得到；所述的参比电极是一根银丝表面镀一层氯化银，然后将该镀有氯化银层的银丝固定于原位电解池池壁上，保证在池内部分全部为镀有氯化银层的银丝，裸露的银丝在池外，作为参比电极接线点。

4.根据权利要求1所述的用于定量检测单个活细菌粘附行为的原位测试方法，其特征在于，所述环境腔的上边缘和AFM基盘之间、其下边缘与和光学倒置显微镜的载物台之间均设有环形硅胶垫，从而使环境腔内部形成密封环境，用于维持不同的测试环境。

5.根据权利要求1所述的用于定量检测单个活细菌粘附行为的原位测试方法，其特征在于，所述光学倒置显微镜载物台的中心圆孔用盖玻片密封。