[发明专利]体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法

说明书

本发明属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法。包括具体方法为：NK细胞体外高效扩增技术优化及NK免疫生物学特性检测；应用RT‑PCR方法检测肿瘤细胞及肿瘤组织中NKG2D配体MICA，ULBP 1,2,3的mRNA表达；NKG2D克隆载体的构建；NKG2D真核表达载体的构建；真核表达载体在CHO细胞中的表达及鉴定；真核表达载体转染NK细胞及对NK细胞生物学功能影响。本发明提供一种利用基因工程技术构建pEGFP‑N1/NKG2D真核荧光表达载体，将构建好的pEGFP‑N1/NKG2D质粒转染NK细胞，应用MTT方法检测NKG2D转染前后NK细胞增殖情况和对肿瘤细胞系的杀伤效应，RT‑PCR方法检测相关杀伤分子IL‑2、TNF‑a、Perforin、TWEAK的mRNA表达水平，为肿瘤治疗提供新思路的体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法。

技术领域

本发明属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是体外高效扩增NK和转染NKG2D 活化NK细胞的方法。

背景技术

采用新细胞因子组合方案在体外成功高效扩增高纯度NK细胞技术的基础上，继续优化 NK细胞临床产业化培养方案和选择NKG2D这一活化受体靶点分子，对NK细胞进行了NKG2D修饰，期望获得具有更好靶向性、更高杀伤活性及持久性的靶向肿瘤细胞分子的NK细胞，具有重要的临床价值和科学意义。

肿瘤在机体内的发生发展过程中，NK细胞均可以起到“控制”作用，基于NK细胞的肿瘤免疫治疗具有良好的临床应用前景。虽然NK细胞在临床应用上的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的10％-20％，因而如何获得高纯度、高质量的NK细胞成为治疗的关键。所以有必要建立一种NK细胞体外扩增技术，用于研究NK细胞的功能，并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。从产业化制备NK细胞的角度出发，建立NK细胞的高效扩增技术以及分析与功能相关的免疫表型等，为其下一步的临床应用奠定基础。

健康的供体可通过白细胞单采术及免疫磁珠分选来获得纯度很高的NK细胞，但使用这两种方法取的NK细胞过程中会造成细胞的活化及损失，故很难得到大量纯度很高的NK细胞，另外临床补充血源途径中脐血来源，由于脐血数量的限制而不能采用单采术来获得足量的NK细胞。传统的NK细胞扩增技术由于扩增效率不高且纯度不够未能得到广泛应用。在扩增的过程中添加辅助细胞提高NK细胞扩增效率等，并以此细胞来刺激NK细胞的增殖，但最后发现其结果并不十分理想。故通过何种办法能有效地在体外获得数量足够且纯度较高的NK细胞，这仍然是NK细胞临床治疗需要解决的问题。

研究发现，综合使用各种细胞因子或许在体外、体内有助于NK的增殖及效应功能。γ链细胞因子在NK细胞增殖及功能发挥上发挥了重要作用，该家族成员包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21等。在NK细胞分化过程中，不同的细胞因子都具有不同的作用。

在前期利用不同细胞因子组合方法建立体外高效扩增高纯度NK细胞技术，拟进一步优化NK细胞培养方案，并为了提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的特异性，继续对NK细胞进行基因修饰活化。

基因修饰可以作为一种技术手段改变细胞的功能，已经被广泛应用于多种细胞如T细胞、 DC、单核细胞和NK细胞等。尤其是对细胞进T行基因修饰，已经取得了长足进展。NK细胞在这方面的研究明显落后于T细胞，但随着理论研究的深入和技术手段的发展，已逐步走上正轨。

NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制性受体，NK细胞对靶细胞效应功能取决于活化信号与抑制性信号的综合，即何者占优势。活化受体识别经典、非经典的MHC I类分子或MHC I类相关分子，在NK活化的启动方面起关键作用，其中尤为引人注目的是 NKG2D，NKG2D不仅表达于所有的NK细胞，而且在NKT细胞和活化的巨噬细胞均有表达。