[发明专利]靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体及其应用，该方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，选取水稻粒型调控基因SLG7的靶位点序列以及相应的上游引物和下游引物，先后构建中间载体和最终载体；将最终载体转染到水稻愈伤组织中，获得2种水稻粒型调控基因SLG7的突变体和相应的小粒型转基因水稻植株，即完成水稻粒型调控基因SLG7的靶向敲除。该方法应用于短粒水稻品种的选育，可以免去杂交选育的工作，大大缩短短粒品种选育的周期。

技术领域

本发明属于水稻基因分子育种领域，特别是靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体及其应用。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，全球近三分之二人口以水稻为主食，世界各地均有栽培水稻的历史，是人类赖以生存，并且无法割舍的食物命脉。近年来，人们生活水平和消费水平不断提高，水稻产量也不断提高，科学家们将关注点放在了改善稻米品质上，尤其稻米的外观品质。稻米的外观品质主要包括粒型和垩白，改善稻米的粒型是科学家们不断追求的育种目标。近年来，有关水稻粒形调控相关基因的克隆与功能研究已取得了长足的进展，从不同的水稻种质资源中已经分离出至少几十个粒形相关基因或等位基因，分布在不同的染色体上，其遗传机制和效应也大不相同。例如GS3、GLW7、GS9、GL6、GW2、GW5、GS5和GW8等。

SLG7(Slender grain on chromosome 7)扬州大学梁国华教授团队利用美国超长粒粳稻品种Azucena和我国籼稻骨干品种9311构建遗传群体图位克隆的一个水稻重要粒形基因，形态学和细胞学机制研究表明，来源于Azucena的基因SLG7通过纵向增加细胞长度横向减少细胞宽度而产生纤细的颗粒，使谷粒变得细长，外观品质更好(Yong Zhou，etal.Natural variations in SLG7 regulate grain shape in rice.Genetics，2015，201：1591–1599)。基因SLG7编码了一个由941氨基酸组成的未知蛋白，与拟南芥中的LONGIFOLIA蛋白同源。进一步研究表明，该基因通过纵向增加细胞长度，横向减少细胞宽度而产生细粒。

CRISPR/Cas9系统是探究基因分子的生物学功能和分子互作机制的一个精准、高效的技术手段，通过向导RNA与基因靶位点序列结合，在Cas9蛋白的作用下对靶DNA分子进行剪切，DNA分子发生断裂后自动修复，在修复的过程中出现碱基插入、缺失或替换，导致翻译提前终止，最终使原有的基因丧失功能。

过去，水稻育种主要通过杂交和回交的方法将粒型基因导入到其它的水稻品种中，这个方法获得不同粒型的水稻株系的周期较长、工作量大、成本高。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统直接对水稻的基因SLG7进行定点突变，创制不同粒型水稻株系，可以大大的缩短水稻育种的周期，目前，尚未有人针对水稻的基因SLG7，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻粒型进行研究。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体，以及创制新的水稻粒型的应用方法，可利用CRISPR/Cas9基因编辑技术简便、快速、高效的得到小粒粒型的粳稻品种，为不同粒形性状的水稻新种质创制提供一种快速、高效地分子育种方式，具体通过以下技术实现。

靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，选取水稻粒型调控基因SLG7的靶位点序列以及相应的上游引物和下游引物，先后构建中间载体和最终载体；将最终载体转染到水稻愈伤组织中，获得水稻粒型调控基因SLG7的突变体和相应的转基因水稻植株，即完成水稻粒型调控基因SLG7的靶向敲除；

所述靶位点序列为水稻粒型调控基因SLG7的第三外显子起始密码子的第609-628碱基序列的片段，所述靶位点序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。