[发明专利]一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针

说明书

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，其是基于环化重排荧光蛋白技术和亚克隆技术设计制备的生物探针。该探针包括可检测CD166的检测单元CY166，和CD34的检测单元YE34，再将两个检测单元依次与载体质粒连接构成重组质粒，转染到活的MSCs后能够自行表达，实现动态检测荧光信号的颜色不同和有无来定性反应细胞表面标志蛋白的变化，进而确定MSCs的分化状态，且对细胞无损害；也可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，进而通过扫描荧光发射波长强度检测CD166和CD34，进而实现检测液体中的CD166和CD34。

技术领域

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，具体地，涉及一种基于环化重排荧光蛋白(circularly permutedfluorescent proteins,cpFP)技术的检测细胞膜蛋白CD166和CD34的生物探针。

背景技术

修复受损的血管内皮细胞或构建可替代的人工血管对心脑血管疾病的治疗具有重要意义。干细胞移植和以干细胞为基础的细胞组织工程是目前解决以上问题的首选。干细胞扩增和定向诱导间充质干细胞(MSCs)分化为内皮细胞是核心环节，但目前对MSCs分化状态的鉴定手段多为传统免疫鉴定方法，存在检测精确度低、不能动态检测、检测后细胞废弃等问题，成为制约此技术发展的关键。因此，本发明提出一种基于活细胞荧光技术的生物探针，用于检测MSCs特异性标志蛋白和分化为内皮细胞的标志性蛋白，从而明确细胞的分化状态。它具有时间分辨率高、成本低、精准实现单细胞水平的无伤检测等优点，从而为MSCs扩增和定向分化为内皮细胞提供动态检测工具。

发明内容

本发明提供一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，其为基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针，其可检测活的MSCs表面标志性蛋白CD166，同时还可以检测内皮细胞标志物CD34。其基于环化重排荧光蛋白(circularly permutedfluorescent proteins,cpFP)技术和生物工程亚克隆技术设计制备探针工具。该生物探针蛋白在活细胞内可自行表达，基于蛋白构象与互作特异蛋白的关系，通过荧光信号的有无及强度定量地反映活细胞膜蛋白CD166和CD34的表达水平，应用于活细胞内检测细胞膜蛋白CD166和CD34；也可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，进而通过扫描荧光发射波长强度实现检测膜蛋白CD166和CD34，应用于液体中的膜蛋白CD166和CD34检测。

本发明通过构建生物探针，基于特异性互作蛋白特异性，实现细胞膜蛋白CD166和CD34的可视化。其中检测探针包括检测CD166的检测单元CY166，以及检测CD34的检测单元YE34，其中每个检测单元由不同颜色的cpFP荧光蛋白序列和膜蛋白互作蛋白序列两个部分，运用亚克隆技术，即聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)、核酸特异性酶切和连接实验技术，对这两个部分的DNA序列进行剪切和拼接重构，并与pcDNA3.1(+)或pRSET-B载体形成重组质粒也可直接通过基因合成构成重组质粒。其中探针设计截取的检测膜蛋白CD166的互作蛋白C6的必需部分，要求可特异性与细胞膜蛋白CD166结合，减少使用CD6序列全长而导致的多实验难点以及其他结构域有可能其他蛋白结合的干扰；同理截取特异性检测CD34的互作蛋白CrkL的必要区域。检测单元CY166检测原理为，当检测结构域CD6-R和CD6-F特异性与CD166结合后，荧光蛋白形成闭合环状结构后发出荧光，从而实现检测CD166的目的；检测单元YE34同理。

本发明的技术方案为：

一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，其为基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针，如图1所示，其包括检测单元CY166和检测单元YE34，每个检测单元包括环化重排荧光蛋白cpFP和识别膜蛋白的互作蛋白，其中，环化重排荧光蛋白cpFP是利用一段接头(Linker)将荧光蛋白本体FP原有的N和C端连接，并在其发色团附近重新打开一个N和C端，从而形成环化重排荧光蛋白cpFP。