[发明专利]一种基于细胞线粒体质量评估的T细胞PD-1检测方法

说明书

本发明实施例提供了一种基于细胞线粒体质量评估的T细胞PD‑1检测方法，包括以下步骤：S10：获取T细胞；S20：在所述T细胞中加入荧光标记好的单克隆抗体圈出辅助性T细胞，和/或，细胞毒性T细胞；同时加入荧光标记好的PD‑1抗体，得到试样一；S30：在所述试样一中加入线粒体探针，使用所述线粒体探针作为细胞代谢指标，划分出MT‑群和MT+群，得到试样二；S40：使用流式细胞仪对所述试样二进行检测，获得不同代谢水平下PD‑1的表达量；其中，MT‑群为线粒体探针染色后低强度表达群，MT+群为线粒体探针染色后高强度表达群。本发明提供的技术方案通过线粒体质量评估来精细化PD‑1检测表达，使得检测结果更加准确。

技术领域

本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种基于细胞线粒体质量评估的T细胞PD-1检测方法。

背景技术

全称为程序性死亡因子1（programmed cell death protein-1,PD-1）,是一种重要的免疫抑制分子，可在T、B淋巴细胞上持续表达，同时在活化的T细胞表面表达会上调,其提供的信号能够抑制细胞活化，诱导细胞的凋亡，从而下调免疫反应，起到维持细胞的稳态的作用。PD-1最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来，以其为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要意义，其配体PD-L1也是一个重要的靶点，相关的抗体也起着同样的作用。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡，使得肿瘤细胞获得免疫逃逸。根据PD-1/PD-L1的机制作用开发的单抗药物也已上市，并在临床中广泛使用，上市的单抗药物一般都有相对应的伴随诊断试剂，大量研究表明，肿瘤组织样本中PD-L1表达水平越高，患者对于PD-1/PD-L1抑制治疗效果越好，肿瘤组织PD-L1表达水平目前是临床研究、验证和认可度最广泛的PD-1/PD-L1抑制剂疗法预测标志物，但一般组织病理检测都是在确定为肿瘤的情况下，并且能获取其实体组织部位，有很多情况下，可能会存在无法获得准确实体组织的情况，导致检测结果偏差，同时该种检测的主要手段是免疫组化，需要病理医生进行阅片诊断，存在主观影响。

同时，PD-1在T细胞上的过表达也是T细胞衰竭的指标之一（在肿瘤或者慢性感染中），在一些慢性感染疾病中有发现T细胞的PD-1表达，实际上，在健康人T细胞中也可以检测到PD-1的表达，在早前的研究中也有报道，发现与正常受试者相比，癌症患者的PBMC亚群中，CD4+T、NK和Treg等细胞PD-1表达会有变化（增高或者降低）。T细胞衰竭除了与肿瘤或者慢性感染所致的抗原刺激相关，也与机体代谢状态和衰老等相关，在不同的代谢环境（营养物质的用量不同等）下或者机体的衰老状态，T细胞也会呈现衰竭状态，通过线粒体质量评估也是细胞衰竭的指标之一，同时它还能反应细胞的代谢状态。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于细胞线粒体质量评估的T细胞PD-1检测方法，包括以下步骤：

S10：获取T细胞；

S20：在所述T细胞中加入荧光标记好的单克隆抗体圈出辅助性T细胞，和/或，细胞毒性T细胞；同时加入荧光标记好的PD-1抗体，得到试样一；

S30：在所述试样一中加入线粒体探针，使用所述线粒体荧光探针作为细胞代谢指标，划分出MT-群和MT+群，得到试样二；

S40：使用流式细胞仪对所述试样二进行检测，获得不同代谢水平下PD-1的表达量。

其中，MT-群即为线粒体探针染色后低强度表达群，MT+群即为线粒体探针染色后高强度表达群。

进一步地，所述获取T细胞包括以下步骤：

S11：使用淋巴细胞分离液提取分离人外周血样本，得到PBMC；

S12：在所述PBMC中，加入抗体包被的磁珠微球，在室温下孵育15-30分钟，得到标记好的T细胞；