[发明专利]新型人源性单克隆中和性抗体XG-81与XG-83的制备方法

权利要求书

1.新型人源性单克隆中和性抗体XG-81与XG-83的制备方法，包括以下步骤：步骤一，标本采集；步骤二，标本分离；步骤三，滴度检测；步骤四，细胞分离；步骤五，铺板培养；步骤六，细胞筛选；步骤七，序列合成；步骤八，载体构建；步骤九，真核表达；步骤十，结合鉴定；步骤十一，阻断鉴定；步骤十二，病毒构建；步骤十三，中和鉴定；步骤十四，特性筛选；步骤十五，位点选定；步骤十六，突变扩增；步骤十七抗体优化；其特征在于：

其中在上述步骤一中，根据入选标准招募20名康复期患者，并采用非干预性研究方法，对前来复诊的康复期患者每人一次性抽取外周血30mL，得到外周血标本；

其中在上述步骤二中，将步骤一中得到的外周血标本加入人外周血淋巴细胞分离液中，通过梯度离心法，分离出血清标本和PBMC标本；

其中在上述步骤三中，通过化学发光法对步骤二中得到的血清标本进行抗RBD抗体IgG滴度，并利用竞争ELISA法检测血清阻断病毒S蛋白RBD与宿主细胞受体ACE2结合的能力，筛选出高IgG滴度且有阻断能力的血清标本，再以血清标本所对应的PBMC标本作为分离标本；

其中在上述步骤四中，将步骤三中选出的分离标本进行充分悬置，通过CD19+磁珠在磁场中进行细胞分离，并利用BD FACSAria去除分离标本中IgM+、IgD+和IgA+的B细胞，筛选出IgG+的记忆B细胞，再对IgG+的记忆B细胞进行流式检测，得到纯度超过90％的CD19+IgG+B细胞；

其中在上述步骤五中，对步骤四中得到的CD19+IgG+B细胞进行计数，并用含有IL-2、IL-21等细胞因子和3T3-msCD40L饲养细胞的培养基重悬，再按照每孔2个CD19+IgG+B细胞的密度，加入到348孔板中，置于孵箱中培养14天，得到细胞培养液；

其中在上述步骤六中，对步骤五中得到的细胞培养液进行上清液收集，利用化学发光法检测上清液中抗SARS-CoV-2病毒RBD抗体IgG的含量，并根据所得IgG浓度判断CD19+IgG+B细胞的活性和功能，再筛选出阳性孔中具有RBD特异性的CD19+IgG+B细胞的细胞培养液，作为表达B细胞；

其中在上述步骤七中，对步骤六中得到的表达B细胞进行总RNA提取，并以mRNA为模板反转录得到cDNA，再设计重链Fab段的通用性引物，进行PCR扩增，并通过高通量测序方法分析出抗体序列信息，接着设计重链Fab段或轻链Fab段的特异性引物，进行巢式PCR扩增，合成抗体基因组，并通过琼脂糖凝胶电泳方法鉴定并回收目的基因片段，得到具有SARS-CoV-2抗体H和L链基因序列的扩增产物；

其中在上述步骤八中，通过双酶切法对步骤七中得到的扩增产物进行酶切，连接并转化到DH5α感受态细胞中，将抗体基因分别克隆到相应的表达载体上，再挑选菌落并提取抗体表达质粒，得到具有SARS-CoV-2抗体重轻链的抗体真核表达载体；

其中在上述步骤九中，将步骤八中得到的抗体真核表达载体共转染到293F细胞上，收集上清液，得到转染上清液，并使用Protein A重力柱从转染上清液中纯化抗体，再利用BCA法测定抗体中的蛋白浓度，并通过SDS-PAGE凝胶电泳方法验证抗体表达情况，筛选出高蛋白浓度的抗体；

其中在上述步骤十中，利用重组表达的病毒RBD蛋白包被免疫板，并加入适量步骤九中得到的抗体和进行孵育，并设置对照，再加入偶联辣根过氧化物酶的抗人二抗进行孵育，并使用酶标仪测量OD450值，对抗体结合能力鉴定，挑选出强结合性抗体；

其中在上述步骤十一中，使用ACE2包被96孔板，将步骤九中得到的抗体与RBD蛋白孵育后加入，并设置阴性对照，再加入辣根过氧化物酶偶联的抗人二抗，孵育完成后加底物显色，酶标仪下测量吸光度，在吸光值低的样本中挑选出强阻断性抗体；

其中在上述步骤十二中，将高效表达SARS-CoV-2密码子优化后S蛋白的真核表达质粒pCMV-SARS-CoV-2、HIV慢病毒包装质粒pBS-CMV-gag/pol和转移质粒pCMV-EGFP三个质粒载体共转染到293F细胞上，包装成SARS-CoV-2假病毒，并设置对照，再通过SARS-CoV-2假病毒感染的人呼吸道上皮细胞HAE中标记基因EGFP表达的分析，确定SARS-CoV-2假病毒能有效进入细胞，建立可在BSL-2级实验室操作的SARS-CoV-2病毒中和试验技术平台，验证所表达抗体的功能，并综合分析全球不同来源的SARS-CoV-2病毒RBD基因序列，选择对S蛋白传播力与毒力影响较大的突变位点，分别构建不同的强效假病毒；

其中在上述步骤十三中，将步骤九中得到的抗体与强效假病毒在96孔板中共孵育，并加入HAE细胞，裂解细胞，检测荧光素酶活性，根据50％抑制浓度检测抗体中和活性，再利用不同的强效假病毒与抗体共同孵育，对抗体中和能力的强弱和广度进行鉴定，挑选出强中和活性抗体；

其中在上述步骤十四中，对步骤十中得到的强结合性抗体、步骤十一中得到的强阻断性抗体和步骤十三中得到的强中和活性抗体的编码基因序列进行生物信息学分析，比较不同的抗体在不同SARS-CoV-2患者体内的比例，分析不同抗体对SARS-CoV-2感染及疾病转归的影响，进而在步骤就中得到的抗体中挑选出具有强保护作用的强结合阻断中和活性抗体；

其中在上述步骤十五中，将步骤十四中得到的强结合阻断中和活性抗体的抗体序列与RBD蛋白的抗原序列输入Discovery Studio软件系统，并与NCBI晶体库模型比对，选择与目标序列相似度最高的晶体结构，进行同源建模，再通过ZDOCK软件程序对RBD蛋白分子进行柔性对接，使用RDOCK将对接结果优化，并通过计算RBD蛋白与抗体结合表位，选取关键氨基酸的突变位点；

其中在上述步骤十六中，根据十五中得到的突变位点，利用重叠PCR原理设计引物，对强结合阻断中和活性抗体的不同突变位点进行突变，以步骤八中得到的抗体表达质粒为模板，利用引物对每个突变位点分别进行PCR扩增，得到突变扩增产物；

其中在上述步骤十七中，利用双酶切法，对步骤十六中得到的突变扩增产物进行酶切，连接并转化到DH5α感受态细胞中，将突变抗体基因分别克隆到相应的表达载体上，再挑选菌落并提取突变抗体表达质粒，将相应的表达载体共转染到293F细胞上，接着收集上清液，得到转染上清液，使用Protein A柱纯化抗体，并通过SDS-PAGE凝胶电泳方法验证抗体表达情况，挑选出突变表达抗体，利用ELISA法进行亲和力分析，对比分析同浓度的突变表达抗体与RBD抗原的相互作用，得出突变表达抗体的亲和力值，再通过不断突变与筛选，优化高亲和力抗体表达工艺，即得SARS-CoV-2人源性高亲和力单克隆抗体。