[发明专利]病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用

说明书

本发明公开了病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用，包括以下步骤：步骤一，假病毒体系的构建；步骤二，假病毒活性的检测；步骤三，假病毒用于新冠疫苗免疫效果的评估；其中步骤一中根据新型冠状病毒基因组序列号GenBank:MN908947，对数据库中变异位点毒株数量较多且传播范围较广的突变位点进行分析统计，选择40种突变位点用于构建假病毒；步骤二中对S蛋白假病毒的活性进行检测，并分类统计后组成新冠病毒假病毒盘；步骤三中将此假病毒盘应用于SARS‑CoV‑2疫苗效果评估，该发明可以更为全面评估新冠疫苗的免疫效果，特别是评估现行的新冠疫苗是否可以有效地预防新冠病毒突变株的感染和流行。

技术领域

本发明涉及疫苗评估技术领域，具体为病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用。

背景技术

新型冠状病毒SARS-CoV-2入侵宿主细胞主要由刺突蛋白S介导，S蛋白的突变不仅会影响病毒的复制能力和感染能力，其同样可能引起宿主免疫反应变化。尽管SARS-CoV-2的突变频率低于其它无逆转录校正功能的RNA病毒，目前这些突变位点如何影响病毒入侵宿主细胞没有明确结论。另外，病毒表面糖蛋白突变可能发生抗原性漂移(Antigenicdrift)现象，亲本株来源的 SARS-CoV-2疫苗交叉免疫保护作用未知。目前传统疫苗效果检测手段是利用 hACE2和RBD的竞争ELISA或者单一的假病毒中和试验确定；同时S蛋白作为冠状病毒的膜蛋白，在病毒传播人类过程中首先受到宿主免疫压力的影响。反之，S蛋白的突变也势必将引起宿主免疫反应的变化。目前，SARS-CoV-2 在全球的传播导致大量的突变毒株的产生。虽然最近SARS-CoV-2疫苗有关研究结果令人欣慰，然而不断产生的突变毒株对疫苗设计提出了更高要求，在疫情全球化且毒株快速变异的背景下缺少全面的疫苗评估体系，疫苗接种后有效性的检测标准尚未有明确定义，因此设计病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用是很有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用，包括以下步骤：步骤一，假病毒体系的构建；步骤二，假病毒活性的检测；步骤三，假病毒用于新冠疫苗免疫效果的评估；

其中在上述步骤一中，根据国家生物信息中心2019新型冠状病毒信息库公布的SARS-CoV-2S蛋白基因突变位点分析数据，S蛋白的突变主要分为ACE2 结合区域-非关键互作氨基酸、ACE2结合区域-关键互作氨基酸和非ACE2结合区域，随后选择数据库中变异位点毒株数量较多且传播范围较广的突变位点进行统计，根据新型冠状病毒基因组序列号GenBank:MN908947，密码子优化合成S蛋白全长基因序列并连接真核表达质粒pcDNA3.1(+)得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike；在构建S蛋白突变体时采用点突变的方式对真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike进行反向PCR，正反向扩增引物5’端包含 15-21bp反向互补区域，引物设计时将引入突变包含在互补区域内；对目标质粒扩增后对产物消化，去除甲基化模板质粒后进行重组反应；反应产物转化并进行克隆鉴定，测序正确即为突变成功的S蛋白突变体表达质粒；上述 S蛋白突变体表达质粒分别与HIV-1骨架质粒pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞即可获得S蛋白突变体假病毒；同时未突变的S蛋白表达质粒与pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞后得到新型冠状病毒S蛋白假病毒；