[发明专利]一种N7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种N7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株，其特征在于，通过将野生冠状病毒株中非结构蛋白nsp14中N7-甲基转移酶结构域内的极度保守的活性位点D或Y定点突变成A而得到，所述野生冠状病毒株为MHV，所述MHV中如SEQ ID NO：1所示的非结构蛋白nsp14的第330位点由D突变为A，或第414位点由Y突变为A。

2.一种N7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的N7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株。

3.一种权利要求1所述的N7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

利用克隆载体对宿主细胞进行转染，获得转染后宿主细胞；

对所述转染后宿主细胞进行培养，获得包含编码nsp14点突变基因的重组病毒；

提取所述重组病毒DNA并酶切，获得含nsp14点突变基因的全长cDNA，经体外转录获得RNA；

将所述RNA转染宿主细胞，获得N7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株；

其中，所述克隆载体携带的核酸分子编码的突变体蛋白具有下列突变：非结构蛋白nsp14中N7-甲基转移酶结构域内的极度保守的活性位点D或Y定点突变成A。

4.根据权利要求3所述的一种N7-甲基转移酶缺陷型冠状病毒减毒疫苗株的制备方法，其特征在于，所述突变体蛋白为：

MHV nsp14突变体蛋白：如SEQ ID NO：1所示的野生型MHV nsp14蛋白的第330位的氨基酸由天冬氨酸D突变为丙氨酸A，或第414位的氨基酸由酪氨酸Y突变为丙氨酸A。

5.一种冠状病毒nsp14突变体蛋白，其特征在于，包括对野生冠状病毒株中非结构蛋白nsp14中N7-甲基转移酶结构域内的极度保守的活性位点D或Y进行定点突变而得到，所述冠状病毒nsp14突变体蛋白为：

MHV nsp14突变体蛋白：如SEQ ID NO：1所示的野生型MHV nsp14蛋白的第330位的氨基酸由天冬氨酸D突变为丙氨酸A，或第414位的氨基酸由酪氨酸Y突变为丙氨酸A。

6.一种编码权利要求5所述冠状病毒nsp14突变体蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为：

MHV nsp14突变体核酸分子：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示或SEQ ID NO：4所示。

7.一种表达载体，其特征在于，包含有权利要求6所述的核酸分子。

8.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为包含权利要求7所述的表达载体的工程化细胞系或重组菌。