[发明专利]一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白及其构建的胶体金免疫层析试纸

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列为模板合成p72基因片段，并设计如下引物进行p72基因的扩增，扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收：

上游引物：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGTTAGGTACTGTAACGCAG-3’；

下游引物：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTCAATGGCATCAGGAGGAGCT-3’；

(2)选择XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切pCold TF DNA质粒以使其线性化，并将步骤(1)中收集的扩增产物使用Vazyme exnase II同源重组酶同源重组至线性化的pColdTF DNA载体上，构建得到重组质粒；

(3)将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，筛选出阳性克隆，并进行p72重组蛋白的表达及纯化，即得。

2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列的GenBank收录号为MH766894。

3.由权利要求1或2所述方法构建得到的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白。

4.权利要求3所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白用于制备检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的用途。

5.一种检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括底板和外壳，所述底板上依次固定有吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫；

所述金标垫吸附的金标抗原包括胶体金标记的p72重组蛋白和胶体金标记的鸡IgY抗体；

所述固相硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，所述检测线为所述p72重组蛋白，所述质控线为山羊抗鸡IgY抗体。

6.根据权利要求5所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述金标抗原的制备方法包括分别制备所述胶体金标记的p72重组蛋白和所述胶体金标记的鸡IgY抗体后再混匀的步骤；

所述胶体金标记p72重组蛋白的制备方法如下：取胶体金溶液加入K₂CO₃溶液混匀，再加入权利要求3所述p72重组蛋白，充分混匀后常温静置，再加入BSA充分混匀后进行常温封闭；离心沉淀胶体金标记物，并加入复溶液进行重悬；

所述胶体金标记的鸡IgY抗体的制备方法如下：取胶体金溶液加入K₂CO₃溶液混匀，再加入鸡IgY抗体，充分混匀后常温静置，再加入BSA充分混匀后进行常温封闭；离心沉淀胶体金标记物，并加入复溶液进行重悬；

所述复溶液包括20-30％蔗糖、8-12％海藻糖、3-8％Tween-20、0.1-0.3％PEG20000和0.01-0.02mol/L的pH＝9-10的硼酸盐缓冲液。

7.根据权利要求5或6所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述金标抗原中：

所述胶体金标记p72重组蛋白的蛋白包被量以p72重组蛋白计为4μg/cm，喷涂量以p72重组蛋白计为1μL/cm；

所述胶体金标记的鸡IgY抗体的喷涂量以IgY抗体计为16ng/cm。

8.一种权利要求5-7任一项所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)按照权利要求1或2所述方法制备得到所述p72重组蛋白，并将所述p72重组蛋白进行胶体金标记，得到金标抗原；

(2)在所述金标垫上喷涂所述金标抗原，在所述固相硝酸纤维素膜表面喷涂所述检测线和质控线；

(3)在所述底板上依次组装所述吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，加盖外壳，即得。

9.权利要求5-7任一项所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸在非洲猪瘟病毒体外检测领域中的应用。

10.一种检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，包括利用权利要求5-7任一项所述胶体金免疫层析试纸进行检测的步骤。