[发明专利]组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法

说明书

本发明涉及一种组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法。所述组合物包含L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁。本发明选择L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁进行组合，形成特定配方的组合物，将该组合物与非必需氨基酸添加到无血清培养基中构成特定的无血清培养体系，采用该无血清培养体系对ADSCs进行传代培养时，细胞的增值速率能够高于含血清培养体系。同时，在传代培养中，细胞空泡化得到有效抑制，细胞衰老得到缓解，并且该效果能够达到与有血清培养基相当的水平。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类非造血干细胞，其广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脂肪、脂肪血及胎盘等组织。MSCs具有高度自我更新能力、多向分化潜能，可在体外培养扩增，不仅能够支持造血干细胞的生长，还具有免疫调控的作用；不同的诱导条件下，在体外可分化为骨、软骨、肌肉、神经、心肌、内皮和脂肪等，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。

脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived derived mesenchymal stemcell，ADSCs)从脂肪组织中分离提取出的一类成纤维细胞形细胞。与骨髓间充质干细胞一样，ADSCs在特定的诱导条件下，可以跨胚层向不同的组织类型的细胞分化，形成软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、骨豁肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经元细胞等。由于脂肪组织来源广泛，取材容易，不涉及伦理问题，便于自体移植，并且给患者带来的痛苦较小，因此目前被认为是比骨髓间充质干细胞更有优势的组织工程“种子细胞”的来源。

随着MSCs及其分泌物作为新型的美容抗衰、疑难杂症治疗等领域的高速发展，传统的MSCs培养采用无血清培养体系，目前市面上的无血清培养基大部分具有化学成分明确、无血清甚至无动物源原料添加等优点。无血清培养基虽然很好的避免了血清或动物成分带来的免疫反应、动物病毒等影响，但由于无血清培养基成分相对单一，营养不足，并且部分替代物对细胞可能存在刺激作用，会引起内质网应激或者细胞自噬。因此在MSCs体外连续传代培养的扩增能力上，仍然和有血清体系存在较大差距。

ADSCs在无血清培养体系培养时，面临的问题相对于其他种类的MSCs更加严峻，因为ADSCs属于成体干细胞，其体外扩增能力本身就比较有限，如果使用无血清培养基体外培养ADSCs，扩增能力更是会出现显著下降的现象，并且连续传代后细胞空泡化现象十分明显，胞质空泡随着传代次数越来越多，细胞迅速老化，随着空泡越来越大，最终细胞破裂死亡。

鉴于ADSCs的特殊性，其对无血清体系的要求更加严苛，传统用于MSCs的无血清培养体系根本无法满足ADSCs培养需求，传统的无血清培养体系例如：

一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和血清替代物，所述血清替代物的添加量为基础培养基质量的3.5％～4.5％，所述血清替代物包括以下组分：人血清蛋白、白蛋白、转铁蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、雌二醇、维生素B2、辅酶A、维生素B12、牛磺酸、丙酮酸、西那卡塞、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子2型受体、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素、胰岛素样生长因子、胰岛素、重组人生长激素、蛋白酶抑制剂、胰酶抑制剂、L-谷氨酰胺、转化生长因子-α、转化生长因子-β、白细胞介素21以及造血细胞生长因子。