[发明专利]检测H7亚型高低致病性禽流感病毒的特异性引物和探针及试剂盒

说明书

本发明公开一种检测H7亚型高低致病性禽流感病毒的特异性引物和探针，同时提供包括特异性引物和探针的试剂盒。本发明的试剂盒，使用基因特异性引物、探针、逆转录和PCR反应在一管内完成，操作方便，并降低了污染风险，实现禽流感病毒H7亚型高低致病的快速检测，在检测AIV‑H7亚型高致病与低致病鉴别检测只需54min，缩短检测时间，提高检测效率，可以用于禽的拭子、血液、血清、血浆、组织中的高低致病性H7亚型禽流感病毒检测。

技术领域

本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域。

背景技术

禽流感（Avian influenza，AI）是由正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒（Avianinfluenza virus，AIV）引起的禽类(家禽或野禽，及部分哺乳动物)的动物传染病。禽流感病毒为单股负链ＲＮＡ，多形态的囊膜病毒。AIV基因组分为８个节段，根据病毒囊膜表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两个糖蛋白抗原性不同，禽流感病毒分为多个血清亚型，其中RNA片段4编码血凝素(HA)，它是AIV基因组中变异率最大的一个片段，不同亚型病毒以及同一亚型不同毒株之间均有很大差异。其中，高致病禽流感（HPAI）主要是H5亚型、H7亚型、H9亚型，在危害级别上HPAI属于我国一类动物疫病，OIE法定报告的动物疫病。

至今为止，从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，另外，禽流感病毒除了可以感染禽类外，部分亚型也能感染人，如在2013年春，我国华东地区先后发生不明原因重症肺炎病例，经病原体分离鉴定为H7N9亚型AIV，但该病毒对家禽表现低致病性。2016年10月，H7N9第5次流行时，H7N9亚型发生了突变，对家禽表现高致病性，高致病性禽流感可引起鸡群100％死亡。但在同一个亚型中病原突变并分别表现出高致病与低致病，在禽流感中并不多见。

基于此，需要建立一种特异性好、敏感性高、准确可靠、快速简便的高低致病性禽流感病毒检测方法，确定高致病性或低致病性，对保障养禽业的健康发展意义重大，同时对人类健康同样具有积极的意义。

发明内容

针对目前现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种检测H7亚型高低致病性禽流感病毒的特异性引物和探针，同时提供包含上述特异性引物和探针的试剂盒是本发明的另一发明目的。

基于上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种检测H7亚型高低致病性禽流感病毒的特异性引物和探针，所述特异性引物为H7-F和H7-R，

H7-F的序列信息：5’-GRAAATGTCCRAGATATGTTA-3’，

H7-R的序列信息：5’-ATTAGKCCTTCCCATCCATT-3’；

探针为H7-M和H7-W，

H7-M的序列信息：5′-AAACGGATTGCGA-3′，

H7-W的序列信息：5′-TGGTGCYATAGCDGGTTTCATTG-3′。

H7-M的5′端进行报告荧光染料FAM标记，3′端进行荧光淬灭基团MGB标记，H7-W的5′端进行报告荧光染料VIC标记，3′端进行荧光淬灭基团BHQ1标记。

一种检测H7亚型高低致病性禽流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物和探针。

所述试剂盒还包括反转录试剂、扩增试剂、ddH₂O、模板。

引物H7-F和H7-R浓度均为50μM，探针H7-M和H7-W浓度均为20μM。

试剂盒包括反转录试剂0.2-0.4μL、扩增试剂8-10μL、特异性引物：50μM H7-F和H7-R各0.1-0.3μL、探针：20μM H7-M和H7-W各0.3-0.5μL，模板1-3μL，加入ddH₂O至20μL，模板为阳性对照、阴性对照中的一种或两种。