[发明专利]一种原核生物来源的Mbp_Argonaute蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种原核生物来源的Mbp_Argonaute蛋白及其应用，所述Mbp_Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或如与SEQ ID NO：1具有至少50％或至少80％同源性的序列所示。本发明合成了一种来源于耐冷原核生物Mucilaginibacter paludis的Argonaute蛋白基因，将该蛋白命名为MbpAgo，研究发现该MbpAgo对单链向导DNA具有结合活性，并且对与单链向导DNA互补配对的靶RNA和/或靶DNA具有核酸酶活性，因此可利用所述MbpAgo进行体内外靶向RNA编辑，进而对遗传材料进行特异性位点修饰。所述MbpAgo不仅可对高级结构的RNA进行修饰，而且不会影响动植物细胞的内源RNAi途径，为RNA编辑提供了一个全新的有力工具，并且切割活性强，特异性好。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种原核生物来源的Mbp_Argonaute蛋白及其应用。

背景技术

目前，真核生物来源的Argonaute蛋白(简称eAgos)能够在常温条件下催化RNA向导(gRNA)引导的RNA切割反应，并在体内的RNA干扰(RNA interference，RNAi)途径中发挥至关重要的作用。原核生物来源的Argonaute蛋白(简称pAgos)相比eAgos功能和结构更加多样化，但其生理功能长期以来难以捉摸。早期研究主要集中于高温生物来源的pAgos，除了Marinitoga piezophila来源的MpAgo偏爱利用5’末端羟基化(5’OH)的向导RNA(gRNA)切割靶单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)和靶RNA之外，其余高温来源的pAgos都偏爱利用5’末端磷酸化(5’P)的gDNA切割靶ssDNA和/或靶RNA。然而高温生物来源的pAgos在中温条件下都只有低水平的gDNA引导的靶ssDNA和/或靶RNA切割活性，这限制了基于pAgos的RNA编辑技术的应用开发。最近的研究开始集中于中温生物来源的pAgos，以期找到能够在中温条件下有效切割靶DNA和/或靶RNA的pAgos。

几乎所有已经表征的中温pAgos都偏爱在中温下催化gDNA引导的靶DNA切割，RNA切割活性不强。Natronobacterium gregory来源的NgAgo可以在常温下在gDNA的引导下切割靶RNA，但它的切割位点不确定，且并未证明能切割具有高级结构的RNA。此外，尽管eAgos被认为自pAgos进化而来，但是目前表征的pAgos并不能像eAgos一样在中温下催化gRNA引导的靶RNA切割反应。

长期以来，人们广泛关注靶向RNA的可编程核酸内切酶，因为这类酶可以应用于RNA结构功能研究、核酸检测领域、RNA纳米技术和RNA治疗学等领域。早期使用的的方法都存在一定的局限性，例如需要大量重新设计或针对每个靶标的额外选择性进化。新近发展的CRISPR/Cas核酸酶正迅速应用到核酸检测领域和病毒清除领域。但CRISPR/Cas核酸酶需要RNA向导，而RNA向导必须在体外转录和纯化，或者需要化合合成。此外，该类核酸酶尚未显示出识别结构化的RNA元件的功能。有的eAgos能够在gDNA的引导下在中温切割几乎所有类型的RNA，但大多数动植物细胞内存在RNAi途径，这些eAgos可能会干扰细胞本身的RNAi功能，这阻碍了将eAgos应用于细胞内的RNA编辑。而原核生物体内不存在RNAi途径，因此pAgos可能不会影响细胞本身的RNAi功能。RNA编辑领域仍然存在对能在常温条件下发挥作用并能应用于动植物细胞的RNA编辑的pAgos蛋白的迫切需求。