[发明专利]一种利用木糖产三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株利用木糖生产三乙酸内酯的重组解脂耶氏酵母菌株及其应用。所述工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，导入2‑吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，同时过表达木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因，得到重组解脂耶氏酵母工程菌。进一步优化发酵过程，开发了解脂耶氏酵母利用木糖产三乙酸内酯的最佳生产工艺，并使其产量达到目前报道摇瓶中的最高水平，产量在3g/L～6g/L之间，为后续开发廉价碳源生产高价值平台化合物三乙酸内酯提供底盘菌株奠定了基础。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株利用木糖生产三乙酸内酯的重组解脂耶氏酵母菌株及其应用。

背景技术：

三乙酸内酯是一种联系生物转化与化学催化的“桥梁化合物”，含有2-吡喃酮结构，可以通过水解、催化加氢等方式转化成各种高价值中间体或终端产品，如乙酰丙酮、γ-己内酯，因此被确定为潜在的生物可再生平台化学品，是一种有价值的商业化合物合成前体，在材料、化工等传统领域需求量大。此外，由于三乙酸内酯具有无毒无害，低腐蚀性的特点，因此也被广泛应用于食品、医药等生命健康领域。

目前，三乙酸内酯的生产方法主要包括化学合成法和生物发酵法，化学法主要是依靠石油裂解、乙酸热解等，该法依赖化石资源，能耗大，环境污染大，生产成本高，且随着化石能源的耗竭，三乙酸内酯价格上涨。生物法主要包括植物提取法和微生物发酵法。植物提取法主要从植物非洲雏菊中提取，该法来源少，需要占用大量的农田耕地种植，加之提取产率低，工艺复杂，不能满足年需几千万吨的工业需求。因此，以天然可再生资源为原料、利用基因工程为手段、以微生物发酵为途径生产三乙酸内酯的微生物生产法成为了当今的研究热点。该法原料价格低廉，生产成本低，无环境污染，副产物少，开发和利用生物质能源转化既符合我国国情，又符合可持续发展战略。相比于大肠杆菌和酿酒酵母，解脂耶氏酵母耐受性高、环境适应能力强，具有高通量聚酮合成前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A代谢流，是工业化生产三乙酸内酯的优势宿主。

木质纤维素来源于农林残渣、废弃物，是含量丰富、价格低廉的可再生资源，目前已有很多报道表明木质纤维素可生物转化为有价值的产品。木糖来源于木质素降解，是木质素的主要糖成分，占木质纤维素生物量的30-40％。木糖的高效快速生物转化是实施经济可行的木质纤维素水解物生物转化工艺的先决条件。目前，已有很多研究表明木糖可转化成木糖醇、2,3-丁二醇、异丁醇聚羟基丁酸酯等生物燃料和化学品，应用前景广阔。

解脂耶氏酵母存在完整的木糖代谢途径，但该途径关键基因在天然条件中处于沉默表达，解脂酵母不能在以木糖作为唯一碳源的培养基中自然生长，主要是由于木糖代谢途径的三个关键酶木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶的活性过低。因此需要利用基因工程手段来增强三个关键酶的活性，从而增强菌株的木糖代谢能力。然而，利用基因工程方法在解脂耶氏酵母中构建木糖代谢途径来异源合成三乙酸内酯的方法还未见报道。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将通过基因工程手段构建一株能够利用木糖的解脂耶氏酵母，并提供该菌株以木糖为碳源生产三乙酸内酯的方法。

本发明提供的技术方案之一，是一种解脂耶氏酵母基因工程菌，所述工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，导入2-吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，同时过表达木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因，得到重组解脂耶氏酵母工程菌；

进一步地，2-吡喃酮合成酶编码基因、木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因的表达方式可以是质粒表达，也可以是基因组整合表达；

优选地，所述质粒表达采用的表达载体为PYLXP’质粒；

进一步地，所述2-吡喃酮合成酶编码基因为植物源基因，包括但不限于来源于非洲雏菊(Gerbera hybrida)的2-吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；