[发明专利]动物粪便宏基因组来源的丙氨酸消旋酶及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种动物粪便宏基因组来源的丙氨酸消旋酶及其制备和应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其经pH 9.0～12.0的缓冲液处理1h后，剩余酶活90％以上；在30℃、37℃、40℃、45℃条件下耐受1h，其仍保持90％酶活；最适辅因子浓度为10μmol/L，在不添加外源辅因子的条件下，反应10min仍然维持77％的相对活性。在pH＝12.0，40℃NaCl条件下，酶的K_m和V_max分别为14.81mmol/L和89.06μmol/L/min，兼有热稳定性和耐碱性，在不添加外源辅因子下仍有较高活性，在酶法合成D‑氨基酸及新型抗菌药物筛选的靶标方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种丙氨酸消旋酶，具体涉及一种动物粪便宏基因组来源的丙氨酸消旋酶及其制备和应用。

背景技术

丙氨酸消旋酶(Alanine racemase，ALR，EC5.1.1.1)是一种以磷酸吡哆醛(PLP)为辅因子，催化L-和D-丙氨酸相互转化的酶类，主要存在于原核及部分真核生物中，与细菌引起的疾病密切相关。研究表明，许多致病菌中均存在ALR，如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、假单胞杆菌(Bacilluspseudofirmus)等。ALR的活性决定了细菌中D-丙氨酸的量，即控制了细菌细胞壁的合成，进而影响致病菌的存活，因此ALR已成为新型抗菌药物筛选的重要靶标。

此外，ALR还是生物酶法合成D-氨基酸的关键酶之一，其消旋产物D-氨基酸作为甜味剂、保湿剂和药物合成中间体，在医药、食品、化妆品等领域具有广泛应用。研究发现，利用多酶偶联反应生产D-氨基酸效率高、选择性好，且能弥补化学拆分法成本较高、有机溶剂对环境造成污染的局限和不足。

然而，近年来ALR在上述领域却并未取得较大成果。一方面，目前发现的许多抑制剂如O-氨基甲酰基-D-丝氨酸、D-环丝氨酸、β，β-三氟丙氨酸等均为丙氨酸的结构类似物，通过与酶的辅因子PLP相互作用而干扰酶的催化过程，缺乏靶特异性，使其他无关的PLP依赖酶失活，导致细胞毒性，因此在临床应用上受到很大限制。另一方面，微生物酶蛋白催化活性低和稳定性差等因素，限制了生物酶法合成D-氨基酸的规模化推广和应用。因此，从不同环境微生物中获得更多ALR，对于ALR抑制剂的筛选及酶法合成D-氨基酸都具有重要意义。

目前，对丙氨酸消旋酶的研究主要是从环境样品中直接筛选产丙氨酸消旋酶的菌株，再提取单菌株基因组DNA，设计兼并引物克隆丙氨酸消旋酶基因，但是环境中绝大多数微生物是不可培养微生物，因此通过传统分离培养的方法筛选新型ALR大大限制了筛选的广泛性、有效性以及安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物粪便宏基因组来源的丙氨酸消旋酶及其制备和应用，该丙氨酸消旋酶利用宏基因组学技术获得，具有良好的热稳定性和耐碱性，在酶法合成D-氨基酸及新型抗菌药物筛选的靶标等方面具有潜在的应用价值。

为了达到上述目的，本发明提供了一种动物粪便宏基因组来源的丙氨酸消旋酶，该丙氨酸消旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是提供所述的丙氨酸消旋酶的编码基因，该丙氨酸消旋酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供一种包含所述的编码基因的重组载体。

优选地，采用的载体为质粒pEASY-E2。

本发明的另一目的是提供一种包含所述的编码基因的重组菌。

优选地，采用的菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的另一目的是提供所述的丙氨酸消旋酶的制备方法，该方法包含：