[发明专利]一种用于卵巢癌早期诊断及预后评估的检测试剂盒

权利要求书

1.一种卵巢癌生物标记物紧密连接蛋白3(CLDN3)酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒具体包括：CLDN3标准品A-F、多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体、阳性对照质控品、阴性对照质控品和辅助试剂。

2.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括：ELISA酶标板、冻干标准品A-F、阳性对照、阴性对照、HRP标记的CLDN3多克隆抗体、25x浓缩洗涤液、底物反应液、反应终止液和封板膜。

3.如权利要求2所述的酶联免疫检测试剂盒中的冻干标准品，其特征在于，其中A-F提取自人血浆，标准品A、B、C、D、E、F中抗CLDN3抗体浓度分别为调至100±10ng/ml，50±10ng/ml，25±2.5ng/ml，12.5±1.2ng/ml，6.25±0.6ng/ml，3.125±0.3ng/ml，将所获得的6份血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成梯度浓度CLDN3标准品。

4.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的多克隆抗体包被板可用CLDN3纯品对Balb/c小鼠免疫获得的多克隆抗体包被酶标板制作而成，具体步骤如下：

(1)制备多克隆抗体：用CLDN3纯品采取腹腔注射和皮下注射免疫Balb/c小鼠，再在腹腔内注射小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；收集腹水经重组Protein G预装层析柱纯化后即获得CLDN3多克隆抗体；

(2)包被：使用新鲜配制的0.02-0.08mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃(pH8-10)溶液将CLDN3多克隆抗体稀释至2-10mg/L，0-8℃过夜，用Tween-20的PBS洗涤；加入100-500μl含有5-20g/L BSA的PBST，37℃封闭1-3h，用PBST洗涤后甩干晾晒，即获得多克隆抗体包被酶标板。

5.如权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，

所述地Na₂CO₃-NaHCO₃的浓度为0.05mol/L；

所述地Na₂CO₃-NaHCO₃ pH为9.6；

所述地CLDN3多克隆抗体稀释至5mg/L；

所述地过夜温度为4℃。

6.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其中辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记CLDN3多克隆抗体制备而成，

其特征在于，具体步骤如下：

(1)取HRP 2-8mg溶于0.1-0.5M碳酸氢钠溶液中，电磁搅拌；

(2)加0.5-2％2.4二硝基氟苯无水乙醇溶液0.05-0.3ml，室温避光搅拌；

(3)加0.01-0.1M过碘酸钠0.5-2ml，室温避光搅拌10-50min；

(4)加0.1-0.2M乙二醇0.1-2ml，室温避光搅拌30-90min；在0.005-0.02M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液4℃透析10-40h，中间换液3-8次；

(5)加入纯化CLDN3多克隆抗体2-10mg的0.05-0.2M(pH9.5)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液0.5-2ml，室温避光搅拌100-200min；

(6)加入2-10mg硼氢化钠，置4℃静置100-300min；

(7)0.02M(pH7.4)PBS，4℃透析12-36h，换液1-5次，即获得HRP酶标多克隆抗体。

7.如权利要求6所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，

所述地HRP为5mg；

所述地碳酸氢钠溶液为1ml 0.3M；

所述地，加1％2.4二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml；

所述地过碘酸钠为0.06M 1ml；

所述地乙二醇为0.16M 1ml；

所述地碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液为0.01M(pH9.5)。