[发明专利]一种提高谷氨酸棒状杆菌重组菌L-赖氨酸产量的方法

权利要求书

1.一种改造HTR基因5′端序列的谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于，是在谷氨酸棒状杆菌宿主菌中，将HTR基因5′端序列中起始密码子ATG前-58位～-49位核苷酸序列^-58ACGTCTAGAC^-49替换为^-58TGTGGTATAA^-49，降低HTR基因5′端序列二级结构的稳定性，使其更易于被转录或表达。

2.如权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌宿主菌为谷氨酸棒状杆菌CICC23604或谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647。

3.如权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于，所述HTR的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.8。

4.如权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于，所述HTR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9；

优选的，所述HTR基因的核苷酸序列为与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9的序列一致性大于等于99.3％的核苷酸序列。

5.如权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于，所述HTR基因5′端序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10；

优选的，所述HTR基因5′端序列为与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10的序列一致性大于等于98.0％的核苷酸序列。

6.权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成上游同源臂-^-58TGTGGTATAA^-49-下游同源臂的核苷酸序列，其中上游同源臂和下游同源臂为HTR基因5′端序列中起始密码子ATG前-58位～-49位核苷酸序列^-58ACGTCTAGAC^-49的前后各一段长度500～600bp的核苷酸序列；

(2)将上游同源臂-^-58TGTGGTATAA^-49-下游同源臂的核苷酸序列连接至pK19mobsacB载体中，构建替换载体；

(3)将替换载体转化谷氨酸棒状杆菌宿主菌感受态细胞，筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，获得发生了第一次同源单交换的重组菌；

(4)将发生了第一次同源单交换的重组菌自然传代后，筛选能在10％蔗糖培养基生长但不能在具有卡那霉素抗性的培养基生长的菌落，验证后得到完成两次同源单交换的谷氨酸棒状杆菌重组菌。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

i.步骤(2)中将上游同源臂-^-58TGTGGTATAA^-49-下游同源臂的核苷酸序列连接至pK19mobsacB载体的Hind III、EcoR I酶切位点之间；

ii.步骤(3)中以卡那霉素抗性基因引物采用PCR扩增技术筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，所述引物序列如下：

F1：5′-ATGATTGAACAAGATGGATTGC-3′，

R1：5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3′；

所述PCR扩增的体系为：2×HiFi-PCRmaster10μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，模板1μL，ddH₂O 7μL；

所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

iii.步骤(4)中所用培养基为LBG培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L。

8.权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌在生产L-赖氨酸中的应用。