[发明专利]一种改造TK基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用

权利要求书

1.一种改造TK基因5′端序列的重组棒状杆菌，其特征在于，是在棒状杆菌宿主菌中，将TK基因5′端序列中起始密码子TTG前-92位~-85位核苷酸序列^-92CCAATTAA^-85替换为^-92TGTGGTAT ^-85，降低TK基因5′端序列二级结构的稳定性，使其更易于被转录或表达；所述TK基因为转酮醇酶的编码基因；所述棒状杆菌宿主菌为谷氨酸棒状杆菌CICC23604，所述TK的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述TK基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述TK基因5′端序列为SEQ ID NO.3。

2.一种改造TK基因5′端序列的重组棒状杆菌，其特征在于，是在棒状杆菌宿主菌中，将TK基因5′端序列中起始密码子TTG前-92位~-85位核苷酸序列^-92CCAATTAA^-85替换为^-92TGTGGTAT ^-85，降低TK基因5′端序列二级结构的稳定性，使其更易于被转录或表达；所述TK基因为转酮醇酶的编码基因；所述棒状杆菌宿主菌为谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647，所述TK的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，所述TK基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，所述TK基因5′端序列为SEQ ID NO.10。

3.权利要求1或权利要求2所述的重组棒状杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成上游同源臂-^-92TGTGGTAT ^-85-下游同源臂，其中上游同源臂和下游同源臂为TK基因5′端序列中起始密码子TTG前-92位~-85位核苷酸序列^-92CCAATTAA^-85的前后各一段长度500~600bp的多核苷酸；

（2）将上游同源臂-^-92TGTGGTAT ^-85-下游同源臂连接至pK19mobsacB载体中，构建替换载体；

（3）将替换载体转化棒状杆菌宿主菌感受态细胞，筛选具有卡那霉素抗性的阳性转化子，获得发生了第一次同源单交换的重组菌；

（4）将发生了第一次同源单交换的重组菌自然传代后，筛选能在10%蔗糖培养基生长但不能在具有卡那霉素抗性的培养基生长的菌落，验证后得到完成两次同源单交换的重组棒状杆菌。