[发明专利]一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用。本发明的棒状杆菌工程菌，是在棒状杆菌宿主菌中，替换PC基因5′端序列中起始密码子GTG前‑73位～‑61位核苷酸序列，降低PC基因5′端序列二级结构的稳定性，使其更易于被转录或表达，其中K指代T或G。该棒状杆菌工程菌与原始菌株相比，在L‑赖氨酸合成效率上有一定提高，进而提高L‑赖氨酸产量，降低生产成本，而且与现有的高产L‑赖氨酸的改造方法没有冲突，但是与现有的改造方法是否有相互促进的作用，仍需要进一步验证。

技术领域

本发明涉及一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸最初是从蛋白质水解产物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。后又出现了化学合成法、酶法，使用的化学合成法主要有荷兰的DMS法和日本的东丽法，这种方法最大的缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。1960年，日本首先采用微生物发酵法生产L-赖氨酸。微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化，直到70年代末80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。目前，世界生产赖氨酸的企业大多采用发酵法，生产的为L型赖氨酸，生产工艺已基本成熟。

用于发酵法生产L-赖氨酸的微生物包括多个种属，例如棒状杆菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等，但是，野生型菌株产L-赖氨酸的能力差，代谢副产物多，难以实现高纯度和高产量L-赖氨酸的制备。因此，通常需要获得高产L-赖氨酸的菌株。目前，获得高产L-赖氨酸菌株的方法主要包括诱变筛选育种或者基因工程育种。诱变筛选育种是指通过紫外照射或者其他外界条件刺激，诱导菌株发生不特定的基因位点突变，然后通过筛选获得高产菌株，这种方法缺乏方向性，基因突变位点难以控制，对菌株性能的预期性差。基因工程育种是通过明确的基因改造方式来优化选育菌株，例如通过增加拷贝或者定点突变导入酶活性高的有益酶基因，或者通过敲除不利基因使酶活性/表达消失。目前，谷氨酸棒状杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA认证为“generally regarded assafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒状杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。

基因5′端序列一般是指位于结构基因5′端上游，通常包含有RNA聚合酶识别、结合和起始转录位点的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，其本身不被转录，它的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于基因5′端序列内部，长度因生物种类而异，一般不超过200bp，是典型的顺式作用元件，与转录因子(反式作用因子)相结合调控基因表达的水平、部位及方式(中国专利文献CN109385424A)。基因5′端序列替换可被用于以特定的方式调节基因的表达，如它们的条件表达或过表达。以PCR为基础的基因靶向，通过同源重组实现开放阅读框(ORF)上游调控序列的染色体整合，可以使基因组发生稳定的改变(中国专利文献CN111655860A)。

虽然目前已有很多关于提高L-赖氨酸产量的报道，但是开发新的提高L-赖氨酸产量的方法仍然有其必要性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用。本发明的棒状杆菌工程菌是通过基因工程改造棒状杆菌宿主菌获得，具体策略为运用基因5′端序列替换的方法替换丙酮酸羧化酶(Pyruvate Carboxylase，PC)基因5′端序列的部分核苷酸序列，获得高产L-赖氨酸的重组棒状杆菌。

术语说明：

丙酮酸羧化酶(Pyruvate Carboxylase，PC)：是糖异生的限速酶，广泛存在于细菌、酵母和动物植物中，可在L-赖氨酸和L-谷氨酸的工业发酵生产中补充消耗的草酰乙酸。