[发明专利]一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用

说明书

本发明提供了一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用。本发明首先通过酰胺化反应，分别对DA7R多肽和SDF‑1因子进行叠氮化基团修饰；其次通过琥珀酰亚胺和氨基的加成反应在外泌体表面引入DBCO基团构建DBCO‑外泌体；最终通过无铜点击化学法构建DA7R‑SDF‑1双修饰的功能化外泌体。通过本发明方法获得的双功能化外泌体表现出对卒中部位损伤血管的靶向性和募集神经干细胞的特性，从而增强其诱导神经干细胞向神经元定向分化的能力，最终通过“一体多功能”的外泌体实现神经修复。本发明为基于外泌体的中枢神经系统损伤治疗和功能化外来体的合理设计铺平了道路。

技术领域

本发明属于生物载体靶向递药技术领域，具体涉及一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用。

背景技术

中枢神经系统损伤(如卒中、创伤性脑损伤、脊髓神经损伤等)常常难以治愈，极易导致人体长期残疾，严重影响了患者的生活质量。这主要是由于神经修复目前存在两大难点：神经元再生能力受限和星胶疤痕的形成。广大科研工作者对于中枢神经系统损伤的修复展开了大量的研究，取得了一定的进展。

体外神经干细胞移植被广泛应用于神经修复治疗中，然而受到损伤微环境的影响，神经干细胞存活率低，且外源性干细胞移植还存在“癌变”、血栓和免疫排斥等风险。内源性神经干细胞虽然可规避细胞植入带来的风险，但是其向损伤区域的迁移数量有限，且极容易向星形胶质细胞分化，从而产生星胶疤痕，阻碍神经修复。此外，在实验动物模型中评估过的许多成功的药物疗法，如阿托伐他汀(atorvastatin)和罗素伐他汀(rosuvastatin)等他汀类药物可缓解损伤后的氧化应激反应，减少神经元的死亡。但是受到血脑屏障的限制，这些药物在中枢神经系统的渗透率低于5％，无法实现高效的脑内定位递送。有研究者通过构建双多肽配体共修饰的脂质体同时实现跨血脑屏障和对损伤区神经元的靶向，有效抑制神经元的凋亡，然而，仍无法克服化学药物存在的毒副作用。因此，亟待寻求一种新的治疗策略，能够既对机体安全有效，又可实现定点递送，还能有效募集神经干细胞并诱导其向神经元定向分化，最终实现神经修复。

近年来，外泌体作为一种新型的无细胞替代疗法受到广泛的研究和关注。外泌体是由细胞分泌的具有完整膜结构的细胞外囊泡，可通过内含的RNA、蛋白质等活性分子调控细胞的功能及生物学行为，其作用与其母细胞的特性也息息相关。外泌体还具有良好的跨血脑屏障能力和生物相容性等特点。间充质干细胞分泌的外泌体能够有效地调节缺血性卒中后的神经元突触重塑和功能恢复，也具有对神经炎症的抑制作用，可有效保护受损区的神经元。然而，成熟神经元的固有再生能力有限，神经元再生主要依赖于神经干细胞，而间充质干细胞外泌体缺乏对神经干细胞向神经元分化的诱导能力。

M2小胶质细胞作为一类抑制神经炎症、促进神经修复的重要免疫细胞，其培养基被发现可促进神经干细胞向神经元分化，提示了其分泌的外泌体存在潜在促神经干分化能力。但是另一方面，神经干细胞由侧脑室产生并向损伤区迁移，由于迁移距离过长，导致其向损伤区迁移数量有限。因此，如何提高外泌体对神经干细胞的募集作用是目前亟待解决的问题，构建一种功能化的外泌体实现对神经干细胞的募集和分化作用，将能够有效地实现神经修复和再生。

全身给药后，由于外泌体易被肝、脾等脏器中的单核巨噬细胞系统吞噬并快速清除，导致仅有极少量的外泌体能够到达病灶区，极大地限制了其临床应用。因此，寻找新的技术，对外泌体进行修饰改造，调控外泌体的体内行为，增加其对神经损伤区的靶向性，从而提高递送的有效性，将有望提高外泌体疗法在神经修复中的效果。有前期研究提出不同方式的外泌体的修饰方法，一是通过改造母细胞从而改造外泌体，但是改造方法复杂、成本大且基因改造可能带来潜在的伦理风险等；二是直接改造外泌体，比如通过穿膜法载药，脂溶性或两亲性材料直接进行疏水插入，有研究者利用修饰了靶向抗体的PEG(聚乙二醇)化胶束，通过疏水插膜法，成功在外泌体表面引入PEG和靶向分子，增加了其体内循环时间，并实现了对肿瘤的靶向。但这种方法缺乏特异性和选择性。还有通过化学修饰法直接进行膜修饰，如采用含铜(I)点击化离子催化下，与含叠氮基团的荧光素共价连接，得到共价荧光标记的外泌体。但是Cu(I)离子的使用对细胞有毒性且会干扰蛋白活性。