[发明专利]一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域；氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；同时本发明还提供一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法，通过分离免疫条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞，提取总RNA，再反转录为cDNA；以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨vNAR片段，与载体连接构建噬菌体文库；从噬菌体文库中淘选识别新冠病毒N蛋白的阳性克隆；构建表达载体，诱导表达新冠病毒N蛋白单域抗体，最终获得靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用。

背景技术

冠状病毒隶属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一类单链正义RNA病毒；自1937年发现首个病毒至今，共鉴定多种冠状病毒，分属于α、β、γ和δ属，其中有7种冠状病毒能感染人，分别为α属的HCoV-229E、HCoV-NL63和β属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及2019年底鉴定的新型冠状病毒SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2是可由飞沫携带的呼吸系统病毒，不同于以往任何一种已知的六种能够感染人类的冠状病毒，该病毒在不同的蛋白上至少有17个位点涉及氨基酸的改变，在密切接触的人群里极易人传人，引起爆发性的全面传播，因而亟需快速诊断检测来控制疾病的爆发和蔓延。

SARS-CoV-2基因组由大约30000个核苷酸组成，编码四种结构蛋白，包括S蛋白(Spike protein，棘突蛋白)，E蛋白(Envelope protein，包膜蛋白)，M蛋白(Membraneprotein，膜蛋白)和N蛋白(Nucleocapsid，核衣壳蛋白)，N蛋白，是冠状病毒中含量最丰富的蛋白，也是一种高度免疫原性的磷蛋白，在病毒感染过程中大量表达，每个病毒RNA基因组拷贝都存在近2000个N蛋白单体。在2003-2004年SARS-CoV期间，在病毒感染早期患者的血清样品中即可检测到N蛋白存在，因而N蛋白检测被视为检测SARS-CoV的可靠依据。在SARS-CoV-2大流行以来的研究数据表明，在新冠病毒感染者的鼻咽拭子样品中，检测到大量SARS-CoV-2病毒N蛋白。新冠病毒N蛋白的免疫原性高、在感染者体内的拷贝数高、且其自身蛋白稳定性好，是检测SARS-CoV-2病毒的重要检测靶标。

目前，新冠病毒的检测方法主要依靠核酸检测，即通过qRT-PCR(定量逆转录酶聚合酶链反应)来检测呼吸道样本中存在的病毒基因组RNA。核酸检测具有灵敏度高和并行检测量大等优点，但同时也面临着样品预处理难度大、逆转录试剂成本高以及检测需要先进的实时热循环仪等挑战。抗体的检测可以有效地弥补核酸检测漏检的风险，发挥其在新型冠状肺炎的及时诊治及防控中的作用。特异IgM和IgG是目前最为常用的新冠病毒检测抗体，但临床也有反映出现了较多的假阳性，困扰临床决策。