[发明专利]用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条、制备方法及应用

权利要求书

1.用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

建立蜀宣花牛妊娠早期主要生殖激素变化模式，基于所述主要生殖激素变化模式判断蜀宣花牛的发情周期，并根据发情周期内的主要生殖激素变化模式确定用于开发所述试纸条的关键生殖激素；

利用还原法制备胶体金溶液；

基于所述关键生殖激素筛选单克隆抗体，纯化筛选得到的单克隆抗体，确定筛选的单克隆抗体的标记条件；

制备并纯化金标单克隆抗体复合物；

组装胶体金检测试纸条。

2.根据权利要求1所述的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述主要生殖激素包括促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素，基于蜀宣花牛妊娠早期促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式判断蜀宣花牛的发情周期，并根据发情周期内促黄体素、促卵泡素、孕酮和雌激素的变化模式，选择怀孕激素水平与未孕激素水平差异显著的孕酮作为关键生殖激素。

3.根据权利要求2所述的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，利用还原法制备胶体金溶液包括以下步骤：

加热氯金酸溶液至沸腾，向沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠水溶液直至反应溶液变为红色后，继续加热直至颜色稳定不变；冷却后，向反应溶液中加入超纯水恢复到原体积，加入NaN₃，过滤除菌后得到胶体金溶液，所述胶体金溶液的胶体金颗粒直径为20～35nm。

4.根据权利要求2所述的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述筛选得到的单克隆抗体为牛孕酮小鼠单克隆抗体，偶联物为孕酮(PROG)-BSA(或OVA)抗原；纯化时，将牛孕酮小鼠单克隆抗体放入透析袋中，将透析袋放入磷酸缓冲液中，充分透析过夜，之后将透析后的牛孕酮小鼠单克隆抗体离心去除聚合物，取上清液。

5.根据权利要求4所述的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述确定筛选的单克隆抗体的标记条件包括采用胶体金梯度法确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适pH值。

6.根据权利要求4所述的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述确定筛选的单克隆抗体的标记条件包括采用蛋白梯度法确定牛孕酮小鼠单克隆抗体与胶体金溶液结合的最适浓度。

7.根据权利要求2所述的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备并纯化金标单克隆抗体复合物包括以下步骤：

制备：离心胶体金溶液以去除胶体金溶液中较大的聚合物，利用K₂CO₃溶液调节离心后的胶体金溶液的pH值至8.0，向胶体金溶液中缓慢加入单克隆抗体，室温下搅拌均匀后，向胶体金溶液中加入10％BSA至终浓度为0.4％；

纯化：将胶体金溶液以第一转速离心后吸取上清液，将上清液以第二转速离心后弃去上清液，将沉淀溶解于原体积的TBS溶液中，所述TBS溶液的pH值为8.0，TBS溶液含有1％BSA和0.02％NaN₃，重复离心洗涤2～3次，得到金标单克隆抗体复合物。

8.根据权利要求2所述的用于蜀宣花牛的胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，组装胶体金检测试纸条包括以下步骤：

在底板中间粘贴抗体固相NC膜，所述抗体固相NC膜上设置有检测线和对照线，所述检测线的孕酮抗原的工作浓度为1.0～1.5mg/mL，所述对照线的羊抗鼠IgG抗体的工作浓度为1.0～1.5mg/mL；

在底板上靠近检测线的一端上粘贴探针条带，所述探针条带与所述抗体固相NC膜至少部分重叠，在底板下端粘贴样本垫，所述样本垫与所述探针条带至少部分重叠；

在底板上靠近对照线的一端上粘贴吸水纸，所述吸水纸与所述抗体固相NC膜至少部分重叠。