[发明专利]胆管癌胆汁外泌体的提取方法

权利要求书

1.胆管癌胆汁外泌体的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：标本的采集：步骤1.1：取胆管癌患者胆汁标本10ml-20ml，胆汁标本取自于ERCP或PTCD；步骤1.2：胆汁收集后立即置于干燥试管中，避光并置于4℃冰箱中，2h内以4000r/min离心10min后取上清液并置于无RNA酶的离心管中；步骤1.3：术前抽取空腹静脉血5ml-10ml，血液标本室温静置2h，4000r/min离心l0min，取上层血清于无RNA酶的离心管中；步骤1.4：胆汁及血清标本收集好后放进冰箱冻存备用；

步骤二：外泌体的提取：步骤2.1：离心前一天，胆汁标本从冰箱取出置于4度冰箱融化，得到50ml黄色胆汁；步骤2.2：胆汁以4°、300g、5min离心1次，然后取上清液；步骤2.3：上清以4°、2000g、10min离心1次，然后取上清；步骤2.4：得到的50mL上清液稀释至60mL，以4°、12500g、离心30min，离心结束后取上清液；步骤2.5：得到的胆汁上清液稀释至70mL，过0.22um筛子后，以4°、120000g、离心2h，得到底部沉淀，将该沉淀用无菌D-PBS反复吹打溶解后转移至EP管中，共得到200uL外泌体悬液，NTA检测后置于-80°冰箱中保存；

步骤三：外泌体的鉴定：采用透射电镜观察所提取到胆汁外泌体颗粒形态；采用纳米颗粒跟踪分析技术测定外泌体粒径大小；采用Western blotting检测外泌体表面蛋白标志物的表达情况。

2.根据权利要求1所述的胆管癌胆汁外泌体的提取方法，其特征在于：所述的步骤1.1中胆汁标本均在胆管插入成功后推注造影剂前抽出。

3.根据权利要求1所述的胆管癌胆汁外泌体的提取方法，其特征在于：所述的步骤1.4中冻存备用的温度为-80℃。

4.根据权利要求1所述的胆管癌胆汁外泌体的提取方法，其特征在于：所述的步骤2.5中底部沉淀为外泌体。

5.根据权利要求1所述的胆管癌胆汁外泌体的提取方法，其特征在于：所述的步骤三中所使用的抗体包括CD63、TSG101、Hsp70。