[发明专利]一种重组噬菌体的构建方法

说明书

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种重组噬菌体的构建方法。一种重组噬菌体的构建方法，包括以下步骤(1)提取丝状噬菌体复制型DNA；(2)制备带有目的基因的Tn5转座子DNA；(3)体外插入转座子DNA；(4)转化大肠杆菌DH5αλpir；(5)制备混合质粒文库；(6)转化宿主细胞；(7)筛选重组噬菌体；(8)检测目的基因的表达。本发明的构建方法操作简单，在不依赖目标丝状噬菌体功能基因组研究的情况下就可以构建重组丝状噬菌体，对研究目标重组丝状噬菌体的应用具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种重组噬菌体的构建方法。

背景技术

噬菌体，是专一性感染细菌、古菌和藻类等微生物的病毒。对噬菌体进行遗传改造，可以获得重组噬菌体；通过遗传改造可以强化、改变或赋予噬菌体某方面特性，在抗细菌感染、病原物检测和植物细菌病害生物防治等多方面都具有重要应用价值。如类T7噬菌体尾部基因的替换，改变了其宿主范围；又如在噬菌体基因组中插入荧光蛋白编码基因或荧光素酶基因，所获得的重组噬菌体可用于病原细菌的快速检测。目前，有尾噬菌体的遗传改造方法包括宿主细菌内同源重组和噬菌体基因组片段体外组装，但这两种方法操作相对复杂，技术门槛高。

丝状噬菌体是一类呈丝状结构的噬菌体，其基因组一般小于10Kbs，如大肠杆菌的M13噬菌体。虽然丝状噬菌体基因组为单链DNA，但其复制循环过程中会出现双链环状形状的DNA，即复制型DNA。提取丝状噬菌体的复制型DNA后，可在体外进行酶切和连接等分子操作，插入外源目的基因，随后转化宿主细菌，即可获得重组噬菌体。但该构建该方法的前提是：目标丝状噬菌体的基因组功能清晰，即要求目标丝状噬菌体为模式噬菌体；而非模式丝状噬菌体由于尚缺失功能基因组研究，基因功能还不清晰，不能够通过上述方法构建重组噬菌体。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组噬菌体的构建方法，以解决非模式丝状噬菌体由于尚缺失功能基因组研究，基因功能还不清晰，不能够通过现有方法构建重组噬菌体的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种重组噬菌体的构建方法，包括以下步骤

(1)提取丝状噬菌体复制型DNA；

(2)制备带有目的基因的Tn5转座子DNA；

(3)体外插入转座子DNA：取等摩尔量的丝状噬菌体复制型DNA和转座子DNA，在Tn5转座酶的作用下，37℃孵育2h；

(4)转化大肠杆菌DH5αλpir：采用热激法，利用步骤(3)获得的反应物转化经氯化钙处理制备的大肠杆菌DH5αλpir感受态细胞；

(5)制备混合质粒文库：收集步骤(4)的大肠杆菌转化子，加入液体培养基，混匀，利用SDS碱裂法提取混合菌液中的质粒；

(6)转化宿主细胞：采用电激法，利用步骤(5)提取的混合质粒文库转化丝状噬菌体的宿主细菌，经筛选，获得转化子；

(7)筛选重组噬菌体：随机挑取多个经步骤(6)的转化子，接种于液体培养基中，震荡培养，离心，滤过上清液；将滤液与丝状噬菌体的指示细菌混合培养，于不同时间点检测指示细菌的抗性来判断重组噬菌体的活性；

(8)检测目的基因的表达：将具有活性的重组噬菌体感染宿主细菌，提取感染后细菌的总蛋白，使用外源目的基因所编码蛋白的抗体，通过蛋白免疫印迹检测目的基因的表达情况。

作为优选，步骤(1)中丝状噬菌体为青枯雷尔氏菌的丝状噬菌体RSCq，其复制型双链环状DNA共计7480bp，序列见SEQ ID No.1。