[发明专利]一种小RNA结合序列的枯草芽孢杆菌转录后调控系统

说明书

本发明公开了一种小RNA结合序列的枯草芽孢杆菌转录后调控系统，属于基因工程技术领域。本发明可实现对目的基因的表达进行精确调控的效果，对不同基因进行不同强度的抑制，以取得最佳效果。例如对透明质酸合成代谢途径进行精确的动态调控提高生物合成目标产物的产量。与其他调控方法相比，本发明具有精确动态调控的优势，可同时控制基因组上多个目标基因的表达量，且操作简便，应用广泛。

技术领域

本发明涉及一种小RNA结合序列的枯草芽孢杆菌转录后调控系统，属于基因工程技术领域。

背景技术

随着合成生物学的发展，越来越多的研究需要在基因组上对基因进行精确调控。小RNA (sRNA)广泛存在于微生物体内，其与蛋白质或mRNA结合导致靶基因的抑制或激活表达。依据其与相应靶标mRNA的关系可分为顺式编码RNA和反式编码RNA。顺式编码sRNA与其靶标基因有着相同的基因位点，与靶标转录的mRNA在5’端或3’端有一段重叠区。配对作用的发生可引起基因表达受到干扰或抑制，细菌真菌等微生物中普遍存在的毒素-抗毒素系统 (TAS)便是以这样的机理发挥作用的。毒素和抗毒素通常是细菌基因组上一对相邻的两个或三个基因元件，毒素基因编码稳定的毒素蛋白或多肽，抗毒素基因编码不稳定的蛋白或 RNA，根据毒素-抗毒素系统的作用机理可将其分为六类，其中I和III类的抗毒素均为sRNA，其通过与毒素基因转录的mRNA相结合降低mRNA的稳定性或影响其翻译来抑制基因的表达。

bsrE/SR5是位于枯草芽孢杆菌基因组上原噬菌体P6的I型TA系统，bsrE基因转录为 256nt的mRNA，并编码30氨基酸的疏水性毒素。抗毒素SR5编码163nt的反义RNA。这对基因在bsrE-SR5的3’末端重合113nt。毒素基因bsrE的过表达会导致细胞裂解，而通过抗毒素sRNA的过表达能实现与毒素的中和。其机制是bsrE mRNA与SR5配对形成的双链区能被RNase III特异性识别并切割，从而大大降低其稳定性，在其他RNA酶的作用下进一步降解。

发明内容

本发明利用枯草芽孢杆菌的内源性毒素-抗毒素系统，构建了一种枯草芽孢杆菌转录后调控系统，可实现对多个目标基因的表达进行不同程度抑制。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌转录后调控系统，是按如下方法构建的：先将枯草芽孢杆菌基因组上的内源性毒素-抗毒素系统bsrE/SR5基因序列从基因组上敲除，再将不同长度的毒素基因bsrE的操纵区序列OPR5(与SR5相结合的双链区)整合至枯草芽孢杆菌基因组上不同目标基因终止密码子TAA之后；然后构建抗毒素基因的表达载体，将表达载体转化枯草芽孢杆菌，从而实现对多个目的基因表达进行精确动态调控。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。

在一种实施方式中，所述目标基因包括内源基因或外源基因。

在一种实施方式中，所述目的基因包括绿色荧光蛋白基因，或与目的产物合成代谢途径相关的基因。

在一种实施方式中，所述目的产物包括透明质酸、软骨素或肝素。

在一种实施方式中，所述毒素基因操纵区OPR5的核苷酸序列及其截短序列如SEQID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述表达载体为穿梭质粒pP43-NMK。

本发明还提供一种调控目的基因表达的方法，包括如下步骤：

(1)敲除枯草芽孢杆菌基因组上的内源性毒素-抗毒素系统bsrE/SR5基因序列从基因组上敲除，

(2)将不同长度的毒素基因bsrE的操纵区序列OPR5整合至基因组上不同目的基因终止密码子TAA之后，

(3)构建抗毒素基因表达载体，将表达载体转化至枯草芽孢杆菌中。

在一种实施方式中，抗毒素基因SR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。