[发明专利]一种特异性Dectin-1纳米抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物学及免疫学技术领域，涉及一种特异性Dectin‑1纳米抗体及其制备方法和应用，特异性Dectin‑1纳米抗体的制备方法包括3个工艺步骤：纳米抗体噬菌体文本库的复苏、特异性纳米抗体噬菌体的淘选及鉴定，重组pET‑28a质粒表达载体的构建，诱导特异性Dectin‑1纳米抗体的表达及纯化；制备的特异性Dectin‑1纳米抗体对Dectin‑1重组蛋白、HCECs和RAW264.7细胞具有特异性；Dectin‑1纳米抗体的生产工艺简单、成本低、产量高、易保存，结构简单；将Dectin‑1纳米抗体应用于真菌性角膜炎治疗，生物利用度高、穿透性好、特异性好、角膜毒性小、抗炎效果好。

技术领域：

本发明属于生物学及免疫学技术领域，涉及一种特异性Dectin-1纳米抗体及其制备方法和应用，主要通过噬菌体展示及基因工程技术制备一种特异性Dectin-1的纳米抗体，涉及一种新的特异性Dectin-1的纳米抗体及其编码序列、表达该抗体的载体及宿主细胞、表达该纳米抗体的步骤及优化，并将制备的特异性Dectin-1纳米抗体用于真菌性角膜炎的治疗，验证其在真菌性角膜炎中发挥的抗炎作用。

背景技术：

真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK)是由致病真菌感染引起的一种严重性致盲眼病，植物性外伤为真菌性角膜炎的发生提供了机会，导致真菌性角膜炎的发病率居高不下。目前临床上应用的抗真菌药存在生物利用度低、穿透性差、角膜毒性大等缺点，而手术治疗又存在角膜供体缺乏、术后排斥反应大及真菌感染的复发率高等的问题，导致该病的治疗十分棘手。因此深入寻找特异性强、高效、低毒的药物用于真菌性角膜炎的治疗具有重要的临床意义。

纳米抗体是目前发现的具有结合能力的最小的抗体单位，因为其CDR3区较传统抗体长，纳米抗体能够结合许多传统抗体不能结合的抗原，在多种疾病的诊断中有非常好的应用前景。纳米抗体虽缺失结构，但并未损失其抗体的特性，仍可靶向结合抗原，且纳米抗体具有结构简单、制备容易，具有高溶解性及稳定性，可主动进入细胞内作为胞内抗体等优势。

作为一种重要的模式识别受体，树突状细胞相关的C型凝集素-1(dendriticcell-associatedc-typelectin-1,Dectin-1)广泛表达于上皮细胞及树突状细胞、中性粒细胞等免疫细胞中，可特异性识别真菌细胞壁中的β-(1,3)-D-葡聚糖，诱导机体产生先天性免疫应答，快速介导下游炎症反应的产生，在抗真菌的免疫反应中发挥重要作用，特异性Dectin-1纳米抗体在真菌性角膜炎中的应用尚未见相关的研究，特异性Dectin-1纳米抗体在真菌性角膜炎中能否发挥抑炎尚不明确。因此，本发明寻求设计一种特异性Dectin-1纳米抗体及其制备方法和作用，制备出的Dectin-1纳米抗体特异性好、溶解度高、毒性小，具有良好的抗炎效果。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计提出一种特异性Dectin-1纳米抗体及其制备方法和应用，以解决现有抗真菌药物生物利用度低、毒性大、水溶性差、稳定性差、活性低、亲和力差、起效慢、抗炎效果差的问题，克服现有抗真菌药物生产工艺复杂、成本高、不易保存、产量低的缺陷，解决真菌性角膜炎治疗药物生物利用度低、穿透性差、角膜毒性大的问题。

为了实现上述发明目的，本发明涉及的特异性Dectin-1纳米抗体的制备方法包括3个工艺步骤：