[发明专利]一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的方法

说明书

本发明公开了一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的新方法，涉及生物合成技术领域。本发明制备方法可以有效的仅利用一种酶催化葡萄糖基衍生物来生产葡萄糖二酸，在常温常压下反应6‑24h产率可达1‑4g/L。克服了目前化学生产中能耗高、产生较多有害物质的缺陷，以及目前文献报道中多酶联合体系生产葡萄糖二酸工艺流程中操作繁琐，中间产物较多，下游分离困难等不足。本发明的工艺流程简便，绿色环保，中间产物少，产物易于分离。

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，具体涉及一种基于单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的合成方法。

背景技术

葡萄糖二酸是葡萄糖的一种氧化物，被誉为12种“最有价值的生物炼制产品”之一，在许多领域如材料、医药、食品和能源利用等有着极为重要的意义。在医药方面，葡萄糖二酸具有其清理毒素、降低患癌风险、降低胆固醇水平、降低心脑血管疾病风险、促进肝肠循环等功能；它在动物体内还会与金属离子络合形成金属螯合物，聚集在病灶，用于药物递送或造影显像。在工业方面，葡萄糖二酸和金属的络合反应还可以应用于废水处理、作为腐蚀抑制剂以及具有合成功能性材料前体的潜力，具有很大的研究价值以及经济效益。

葡萄糖二酸的合成方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法主要有硝酸氧化法和2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)催化法等。硝酸氧化法方法简单产率较高，但需要高压高放热反应，并且存在竞争性副反应产生小分子有机酸及有害气体；而反应条件较为温和的TEMPO催化法也存在催化剂昂贵，很难一直维持最佳反应条件等不足。生物酶催化具有技术潜力与绿色环保的优点，有望替代化学合成成为工业生产葡萄糖二酸的新工艺。

2009年，Moon成功在大肠杆菌中构建了葡萄糖二酸的人工合成途径，具体过程是：葡萄糖在大肠杆菌自身的磷酸激酶作用下转化为6-磷酸葡萄糖，接着来自酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合酶(INO1)将6-磷酸葡萄糖催化成肌醇，肌醇被来自小鼠的肌醇加氧酶(MIOX)催化生成葡萄糖醛酸，最后，在辅因子NAD⁺作用下，来自丁香假单胞菌的尿酸脱氢酶(Udh)催化葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸。之后经过Roman、Zheng等人多项研究对其中各种酶进行优化，并补加肌醇产率可达1～4g/L。也有报道利用酵母、红茶菌等生产葡萄糖二酸或其衍生物。但是该方法存在着多酶联合体系下操作繁琐，中间产物较多，产率低且不稳定，下游分离困难的缺陷。

尽管此前的生物合成法仍存在一定的缺陷，但在众多酶与原料之中，还存在的许多的合成的可能途径，因此，关于“如何寻找可行的酶与原料设计合成葡萄糖二酸”成为当前的重要任务。

发明内容

本发明的目的是克服现有多酶联合体系下生产葡萄糖二酸，操作繁琐，中间产物较多，下游分离困难等问题而提供一种基于单酶催化合成葡萄糖二酸的方法，采用工程菌表达的黄素蛋白氧化酶、结合常压常温催化合成葡萄糖二酸，实现从葡萄糖或葡萄糖基衍生物到葡萄糖二酸的高效转化。

一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的新方法，其特征在于，包括以下步骤：以葡萄糖及其系列酸为底物；构建工程菌，诱导表达获得酶液；向底物中添加酶液及过氧化氢催化剂进行反应；分离纯化得葡萄糖二酸。

在本发明实施方式中，底物可以为葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸等葡萄糖基衍生物，浓度为10～100mM。

在本发明实施方式中，所用酶为来自Methylovorus sp.strain MP688中的一种黄素蛋白氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有80％以上相同的同源酶。

在本发明实施方式中，所用酶液获得方法如下：可将所用酶的基因序列转入载体质粒，导入感受态大肠杆菌构建工程菌；将工程菌在培养基中增殖培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入浓度为0.1～5mM的IPTG诱导剂，诱导12～48h后，收集菌体破胞，镍柱纯化得到HMFO酶液。