[发明专利]一种检测人血浆骨化三醇的浓度的LC-MS-MS方法

说明书

一种检测人血浆骨化三醇的浓度的LC‑MS‑MS方法，包括以下步骤：在96孔板中加入样品，使用离心机瞬时离心，将所有的样品加入0.01％FA的水溶液，通过离心处理，取上清液至已活化好的SPE板上，收集的废液弃除，加1mL water至SPE板，加ACN的水溶液至SPE板，使用96孔板作为收集板，加CHCl3，收集板吹干，将收集板的所有样品，加入PTAD溶液，将收集板置于摇扳机上，吹干，将收集板的所有样品，混匀后的样品放置在自动进样器中，进行采样，使用SPE进行血浆样品的分离纯化，提取骨化三醇，使用PTAD对SPE提取后样品进行衍生化反应，提高约10倍信号，通过在流动相中添加微量的乙胺，提高仪器响应信号。

技术领域

本发明涉及骨化三醇浓度的检测领域，具体为一种检测人血浆骨化三醇的浓度的LC-MS-MS方法。

背景技术

截至目前为止，在国内期刊、杂志或者专利文献中，都无法搜索到人血浆中骨化三醇浓度的检测方法。骨化三醇(Calcitriol)为维生素D3经肝脏和肾脏羟化酶代谢为抗佝偻病活性最强的1，25-二羟代谢物。人体内本身就可以产生该物质，为内源性物质，且在服用骨化三醇药物后，因其特殊性，骨化三醇在人体中的血药浓度非常低，给药量从2μg到4μg，骨化三醇在人体血浆中的Cmax也只有约60～150pg/mL。(取自日本橙皮书)。

从大部分的外文文献中可见，人血液中骨化三醇的浓度检测主要以酶联免疫法检测为主，测定的载体是人血清(Pharmacokinetics of oral calcitriol in healthyhuman based on the analysis with an enzyme immunoassay，Su-Eon Jina, Jeong-Sook Park b,Chong-Kook Kima，Pharmacological Research 60(2009)57–60)，由此可知传统检测方法的缺点如下：

缺点1：国内生物分析实验室，以LC-MS/MS检测法为主，酶联免疫法的应用存在局限性。

缺点2：酶联免疫法分析样品时，每个样品需要做复孔。样品量至少增加一倍，需要采集受试者更多血液。

缺点3:采用酶联免疫法分析时，因骨化三醇是小分子药物，使用小分子药物去生产抗体，其产生的抗体亲和力比较差，从而导致方法具有局限性。上述文献中通过采购商业化试剂盒完成检测，试剂盒的成本非常高，按市场行情，每个样品分析成本约500元。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种通用性强、血液采集量小、成本低的检测检测人血浆骨化三醇的浓度的LC-MS-MS方法。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测检测人血浆骨化三醇的浓度的LC-MS-MS方法，包括以下步骤：

步骤1、在96孔板中的相应的位置，加入200μL样品。样品内包括包含标准曲线样品、质控样品、试验样品，空白样品。

步骤2、对于标准曲线样品、质控样品及试验样品，加入50μL内标工作溶液，对于空白样品则加入50μLACN，使用离心机瞬时离心，后将96孔板置于摇扳机以1000rpm混匀1min；

步骤3、将所有的样品加入800μL0.01％FA的水溶液，后将96孔板置于摇扳机以1000rpm混匀5min；

步骤4、将步骤3的样品在通过离心处理，离心参数：4000rpm，10℃， 10min；

步骤5、取800μL上清液至已活化好的SPE板上,经过1mL MeOH及 1mLwater活化，重力滴干，再室温静置10分钟，收集的废液弃除；

步骤6、加1mL water至SPE板，轻微加压，滴干，收集的废液弃除；