[发明专利]一种牙髓干细胞外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及细胞外泌体制备技术领域，具体涉及一种牙髓干细胞外泌体及其制备方法和应用。牙髓干细胞外泌体的制备方法，包括以下依次进行的步骤：将牙髓间充质细胞悬液与低熔点琼脂糖溶液混合，获得混合物，然后将混合物接种在培养容器中，经过预培养和诱导培养后获得含有外泌体的上清液；提取上清液中的外泌体。本方案的制备方法解决采用现有技术方法获得的外泌体治疗的效果有限的技术问题。在本方案获得的外泌体中，miR‑302a/b/c/d家族和miR‑24‑3p等miRNA的表达量得以显著提升，使用三维培养牙髓间充质细胞获得的外泌体具有较为显著的治疗应用潜能。

技术领域

本发明涉及细胞外泌体制备技术领域，具体涉及一种牙髓干细胞外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

牙髓间充质细胞(dental pulp stromal cells,DPSCs)从牙髓组织中分离获得，是一种常用的牙源性间充质细胞，在多种组织的修复和再生研究中被应用。DPSCs来源于神经嵴，具有自我更新和多向分化的高增殖潜力。外泌体(Exosomes，Exo)为细胞通过溶酶体微粒内陷形成的小囊泡，内含丰富的活性物质，如蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等，可在细胞间的信息交流与物质交换方面发挥作用。近来研究发现DPSCs的外泌体(DPSC-Exo)有多种治疗作用，其在再生医学领域也有一些应用的报道。而细胞生长的微环境对外泌体的分泌有影响，通过调节细胞生长的环境可能起到优化细胞外泌体的成分，改变外泌体的治疗潜能。但是，现目前微环境对外泌体确切的调控作用尚不清楚，通过改变微环境来加强外泌体治疗效果尚不能实际实现。亟需对影响外泌体治疗功能的微环境因素进行研究，以明确具体的微环境因素和外泌体之间的调控关系，从而提升牙髓间充质细胞的应用潜能。

发明内容

本发明意在提供一种牙髓干细胞外泌体的制备方法，以解决采用现有技术方法获得的外泌体治疗的效果有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牙髓干细胞外泌体的制备方法，将牙髓间充质细胞悬液与低熔点琼脂糖溶液混合，获得混合物；所述混合物中的牙髓间充质细胞经过预培养和诱导培养，获得含有外泌体的上清液。

采用上述技术方案的原理以及有益效果：本方案在三维(Three-dimension，3D)条件下培养牙髓间充质细胞,通过将细胞植入到具有三维结构的载体中培养,使细胞能够在三维立体空间结构中生长、增殖、迁移及分化等，进而放大间充质细胞旁分泌效应。在本方案中，通过低熔点琼脂糖形成的三维结构可实现对牙髓间充质细胞的立体培养，并大量分泌形成外泌体，上清液中的外泌体可通过现有的试剂盒提取回收获得。

发明人研究发现，外泌体作为细胞旁分泌重要产物，其所含miRNA会随着牙髓间充质细胞三维培养环境的不同而变化。发明人对三维培养的牙髓间充质细胞的外泌体中的miRNA进行表达谱分析，并与二维培养的牙髓间充质细胞的外泌体中的miRNA进行比较，探索比较两种培养条件下外泌体miRNA差异。研究发现，三维培养会影响牙髓间充质细胞的外泌体的miRNA表达谱，三维和二维培养相比较，有60个表达量显著差异的miRNA。表达量显著上调的miRNA包括miR-302a/b/c/d家族和miR-24-3p等。miR-302a/b/c/d家族能够通过双调控细胞周期和凋亡途径来调控hESC(人胚胎干细胞)自我更新，是一类在干细胞发育、增殖、分化等方面都有显著作用的miRNA。其可靶向FGF19与EGFR发挥组织再生与修复功能。FGF19与脂质、葡萄糖等多种代谢途径相关，而人体中EGF与TGFa为EGFR最重要的两种配体，发挥着细胞增殖、血管生成、抑制凋亡等生理功能。miR-24-3p作为一个表观遗传调控因子，在血管内皮细胞的增殖、凋亡、炎性反应等方面均可发挥调节作用，是已被广泛深入研究的miRNA之一。