[发明专利]具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-异亮-亮肽及制备方法

权利要求书

1.具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-异亮-亮肽，其特征在于：所述环色-丝-缬-异亮-亮肽的结构式如下：

所述环色-丝-缬-异亮-亮肽是由色氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽，为白色粉末状；

所述环色-丝-缬-异亮-亮肽具有清除自由基活性和抗白色链珠菌活性；

对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）的半数清除浓度（DC₅₀）为：1.19mg/mL，在200 μg /mL的浓度下对白色链珠菌的抑菌圈直径为13.27mm。

2.权利要求1所述具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-异亮-亮肽的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）菌种培养

将蛙粪霉（Basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；

（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制

用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-丝-缬-异亮-亮肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述蛙粪霉（Basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种。

4.根据权利要求2所述制备特方法，其征在于所述步骤（1）的具体操作如下：

（1.1）斜面种子培养

将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；

（1.2）二级菌种培养

将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；

在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在全温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；

液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麦芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化钾（KCl₂）0.3～2.0 g/L、七水硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）0.3～2.0 g/L、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.3～2.0 g/L；

（1.3）三级菌种培养

将二级菌种接种到大于等于5L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；

发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；

（1.4）四级培养

四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50L的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2MP、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%， 25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麦芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化钾（KCl₂）0.3～2.0g/L、七水硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）0.3～2.0 g/L、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.3～2.0 g/L、琼脂15.0～30.0 g/L和水混合均匀制成。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述步骤（2）的具体操作如下：

（2.1）最终发酵物的预处理

将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000转/分钟条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；

或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；

（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化

（2.2.1）提取

将预处理物，用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（W:V）、超声波功率10～100KHz,提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000转/分钟条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；

（2.2.2）分离纯化

采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即RPC18，颗粒直径为3～50微米；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丝-缬-异亮-亮肽。